miR-221在甲狀腺疾病中的表達及意義

冀　宏，底　旺，嚴　麗，張霖雷,李清懷

(河北醫科大學第二醫院甲狀腺外科，河北 石家莊 050000)

?

miR-221在甲狀腺疾病中的表達及意義

冀宏，底旺，嚴麗，張霖雷,李清懷*

(河北醫科大學第二醫院甲狀腺外科，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的探討miR-221在甲狀腺疾病穿刺細胞活檢組織及外周血中的定量表達及意義。方法51例甲狀腺結節患者采用超聲引導下粗針穿刺細胞活檢法獲取標本，術前抽取外周血標本，采用定量 PCR 法檢測組織及血漿中 miR-221的表達水平。結果miR-221在甲狀腺良性結節組織中的表達與周圍正常組織差異無統計學意義(P>0.05)，miR-221 在甲狀腺癌組織中的表達明顯高于穿刺病灶周圍正常組織(P<0.05)；miR-221在不同甲狀腺癌腫瘤病理分期及有無淋巴結轉移方面表達差異有統計學意義(P<0.05)。甲狀腺癌組外周血miR-221水平顯著高于健康對照組和甲狀腺良性病變組(P<0.05)。結論miR-221高表達與甲狀腺癌的惡化過程關系密切，可為甲狀腺癌術前診斷和個體化治療提供新的思路。

[關鍵詞]甲狀腺腫瘤；聚合酶鏈反應；活組織檢查，針吸

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.011

甲狀腺癌是臨床最常見的內分泌腫瘤，臨床上對甲狀腺癌的術前診斷最常依據彩超檢查，并可進行超聲引導下穿刺活檢來協助診斷，細針穿刺細胞活檢(fine needle aspiration biopsy，FNAB)具有較高的特異度和準確率，但由于一些客觀因素如取材量不當等以及細胞結構特異性不夠，往往導致部分患者不能明確診斷，而隨著超聲引導下粗針穿刺活檢技術的不斷進步，廣泛開展后大大提高了診斷的準確率。戴維德等[1]報道微小 RNA(miRNA)是新近廣泛研究的分子腫瘤標記物，已被證實與甲狀腺癌的發生發展關系密切[2]。在miRNA家族中，miRNA因能反映惡性腫瘤的侵襲程度而受到廣泛關注。在已發生侵襲的甲狀腺癌組織中，有報道發現miR-221基因簇的表達顯著高于未轉移的FTC腫瘤組織，并與腫瘤患者的預后密切相關[3]。另有文獻報道，miR-221在甲狀腺癌中的高表達可作為良惡性腫瘤的鑒別方式[4]。但目前尚無關于將miR-221作為腫瘤標記物的相關報道。本研究應用RT-PCR技術探討miR-221在不同甲狀腺疾病患者術前穿刺活檢組織及外周血中的定量表達情況。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2013年5月—2015年8月河北醫科大學第二醫院收治的行甲狀腺穿刺活檢患者51例，男性13例，女性38 例；年齡 22～70 歲，平均( 45.8±23.6)歲，其中<45歲者25例，≥45歲者26例；手術切除后病理檢查證實為甲狀腺癌31例(乳頭狀癌25例，濾泡癌3例，髓樣癌3例)，有淋巴結轉移18例、無淋巴結轉移13例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期8例；甲狀腺良性病變20例，其中結節性甲狀腺腫17例，橋本甲狀腺炎2例，腺瘤1例。所有患者均無絕對手術禁忌癥，手術前均未接受放療、化療及其他治療，無其他臟器轉移及合并疾病。另隨機選擇我院體檢中心50例無腫瘤病變的健康志愿者用于血清學對照。健康對照組男性18例，女性32例，年齡22～68歲，平均(41.2±21.9)歲。2組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

所有入組者均予以告知，所有患者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2方法所有患者術前均行超聲引導下穿刺活檢術，應用西門子公司Sequoia 512型彩色多普勒超聲診斷儀，穿刺活檢器材為美國巴德公司產BARDVIG1822型全自動活檢槍，穿刺過程中采用18 GTru-cut活檢針(彈射距離分15 mm和22 mm兩檔)。穿刺前患者凝血功能無明顯異常，均停用抗凝藥物7 d以上。穿刺時囑患者平臥位充分暴露頸部，先行甲狀腺常規超聲選取最佳進針角度，常規消毒鋪巾，2%的利多卡因局部麻醉，將18 G粗針在超聲引導下到達腫塊邊緣，穿刺針道及針尖前方避開大血管及氣管等重要器官，按壓活檢槍取得標本送檢。

外周血標本采集：同期采集51例甲狀腺疾病患者術前和50例健康對照組人群外周血標本，對比兩者外周血miR-221表達量。

1.3RT-PCR檢測提取全基因組mRNA，引物由上海生物工程有限公司設計合成。①逆轉錄過程： 將合成的cDNA加A反應在20 μL體系中進行，2 μL10X逆轉錄緩沖液，0.5 μL Poly(A)聚合酶3 mL miRNA混勻后37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，反應的cDNA在-80 ℃低溫冰箱內保存備用。②PCR過程：采用兩步法反應程序，95 ℃變性5 min，40個PCR循環(95 ℃ 5 s、57 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s)；循環結束后60 ℃延伸10 min，每個標本均作復管 PCR 反應，至少重復 3 次。采用相對定量方法(2△△CT)對結果進行比較分析，計算2個復孔的平均值作為每個樣本的實際CT值，同一樣本的CT值減去其內參β-actin的CT值，獲得△CT值，然后同一組的樣本獲得一個平均△CT值，在所有實驗組的△CT值中選擇一個最大△CT(Max)作為衡量的標準，用其他樣本組的△CT值減去△CT(Max)值,最后根據待測基因和內參循環數CT值，按照公式相對值=2△△CT計算出待測樣本待測基因相對于內參基因的相對表達量。

1.4統計學方法應用 SPSS 21.0 軟件進行統計分析，計量資料比較分別采用F檢驗、q檢驗和t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1甲狀腺疾病患者超聲表現所有患者超聲共表現72枚結節，直徑0.5～2.7 cm，形態不規則者24例，邊界不清者7例，周圍有暈環者18例，內可見微鈣化者21例，中央型血供者19例，有甲狀腺囊腫者5例。超聲引導下患者甲狀腺穿刺活檢均一次成功，切割不同層面長條狀甲狀腺瘤樣組織，穿刺過程中無明顯不適主訴，穿刺后僅1例患者因血供豐富而出現穿刺針道出血情況，壓迫20 min后完全止血。穿刺完成后獲得明確的病理結果，31例甲狀腺癌穿刺活檢病理與術后病理結果完全符合，診斷符合率100%。

2.2miR-221在不同甲狀腺組織中的表達情況與病灶周圍正常甲狀腺組織相對比，miR-221在良性甲狀腺結節病灶中表達量無明顯升高(P>0.05)，而在甲狀腺癌中的表達量則顯著增加(P<0.05)，見表1。

2.3miR-221高表達與甲狀腺癌臨床病理特征間的關系miR-221表達水平在不同腫瘤病理分期和有無淋巴結轉移甲狀腺癌患者中差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4miR-221在不同甲狀腺疾病術前外周血中的表達甲狀腺癌、甲狀腺良性病變及健康對照組外周血miR-22相對表達量分別為0.96±0.22、0.35±0.13、0.16±0.11，甲狀腺癌組外周血miR-221水平顯著高于健康對照組和甲狀腺良性病變組(F=258.074，P<0.05)。

表1miR-221在不同甲狀腺組織中的表達比較

組別例數miR-221相對表達量甲狀腺病灶周圍正常組織510.23±0.07甲狀腺良性結節200.31±0.05甲狀腺癌300.89±0.16*# F413.578 P 0.000

*P<0.05與甲狀腺病灶周圍正常組織比較#P<0.05與甲狀腺良性結節比較(q檢驗)

表2miR-221表達與甲狀腺癌病理參數關系

參數 例數miR-221相對表達量tP年齡 <45 ≥4514170.86±0.030.88±0.061.185>0.05性別 男 女10210.86±0.020.85±0.031.099>0.05TNM分期 Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅲ2380.81±0.031.02±0.078.227<0.05淋巴結轉移 有 無18130.98±0.020.83±0.0315.685<0.05

3　討　　論

甲狀腺結節術前FNAB是臨床上廣泛應用并認可的診斷手段之一，有文獻報道FNAB在甲狀腺結節術前診斷的敏感度及特異度均高達90%以上[5]。雖然有學者將FNAB視為診斷甲狀腺結節的首選手段[6]并將其列入甲狀腺疾病診治指南，但由于細針穿刺只能抽吸少量組織液進行細胞檢測，標本量不足造成漏診情況較多，會大大降低其診斷的敏感度和特異度，假陰性率較高，難以準確鑒別良、惡性疾病[7]。為了提高術前診斷準確率，臨床上逐漸開展超聲引導下粗針穿刺活檢，憑借超聲定位優勢，在提高穿刺準確度的同時，降低了觸診活檢的并發癥[8]。相比于細針穿刺活檢，粗針穿刺活檢優點是非常明確的。本研究粗針活檢結果與術后病理結果對比顯示，對甲狀腺癌的診斷符合率可達到100%，具有明顯優勢，此種方法不僅可以切割到長條狀的甲狀腺結節組織，還可以在超聲導引下對不同層面的組織及被膜進行活檢，這對后續的病理診斷及分型是非常有價值的[9]。而本研究5例甲狀腺囊腫患者標本采集過程中在明確診斷的同時，給予囊腫液的抽吸并硬化治療，使囊腫縮小，表明超聲引導下的甲狀腺粗針穿刺活檢不僅診斷價值較高，還可以對良性病變實施有效的微創治療，避免了此類良性病變實施手術切除的風險，降低了患者治療費用。

甲狀腺粗針穿刺活檢在彩超引導下可避開病變周圍大血管、神經及氣管組織，并且可根據腫塊大小及其周圍毗鄰情況選擇不同的切割深度，從而避免損傷重要器官。本研究僅有1例出現針道出血，考慮其周圍血供豐富而損傷小分支供血血管，經壓迫后即可止血，表明粗針穿刺活檢是相對安全可靠的檢查方法。但此項技術的廣泛開展需要獨立的超聲介入科配合，受限于穿刺操作人員的臨床經驗及甲狀腺結節部位血供程度的不同，故在很多基層醫院仍以FNAB為主。針對術前無法明確診斷的甲狀腺結節患者，則需依賴術中冰凍病理檢查或手術后病理檢查來明確診斷，但這部分不能確診患者術中或術后病理檢查結果僅可使20%～25%的患者確診為甲狀腺癌，而其余大部分患者無需手術切除治療。能否在甲狀腺癌中探尋到一項高靈敏度和特異度的分子診斷標志物顯得尤為重要，但目前的相關研究還停留在分子水平，缺少與臨床病理資料的結合。

miRNA是一類由19～25個核苷酸組成的細胞內源性表達的非編碼小分子RNA，廣泛存在于脊椎動物中，具有高度保守性[10]。其表達及在腫瘤機制方面，已在肝癌、乳腺癌、胃癌等多種常見腫瘤中得到了深入研究，而在以甲狀腺癌為代表的內分泌系統癌癥中尚處于起步階段[11]。本研究選擇了miR-221這一在甲狀腺癌及其他多種惡性人類腫瘤組織中均為高表達[12]的亞型進行臨床病理相關研究。對甲狀腺癌患者的全基因組miRNA表達譜進行分析時發現了一個異常的miRNA表達譜，其可以明確區分正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織，而在甲狀腺癌組織中miR-221的表達相比正常甲狀腺組織顯著增加[13]。本研究結果顯示，甲狀腺癌患者血漿miR-221水平顯著高于甲狀腺良性結節及健康對照者(P<0.05)，同時甲狀腺癌活檢組織中miR-221 的表達水平明顯高于甲狀腺良性結節及病灶周圍正常甲狀腺組織。這與相關文獻報道一致[14]。表明 miR-221 高表達可作為甲狀腺癌的潛在標志物，可作為補充診斷方法。本研究結果還顯示，miR-221 在TNMⅢ、Ⅳ患者的甲狀腺癌組織中表達水平明顯高于TNM Ⅰ、Ⅱ期的甲狀腺癌組織，提示miR-221 在甲狀腺癌發生及進展中可能發揮重要作用；同時，miR-221 在有無淋巴結轉移的甲狀腺癌組織中的表達量有明顯差異，表明其在腫瘤的侵襲性方面有重要的意義。機制可能為 miR-221 通過抑制下游基因PTEN 及 TIMP3 的表達，最終使癌細胞容易發生浸潤及轉移[15]。

總之，與正常組織及甲狀腺良性結節相比，miR-221在甲狀腺癌組織中高表達，術前超聲引導下粗針穿刺活檢聯合 miR-221檢測可明顯提高甲狀腺結節的早期診斷準確率并為指導甲狀腺癌的個性化治療提供新的思路。

[參考文獻]

[1]戴維德，韓秀婕，井慶紅,等.超聲引導下粗針穿刺活檢在甲狀腺疾病診斷中的應用[J].山西醫科大學學報，2013,44(8)：621-623.

[2]李墨林，賈婷婷，白晗，等.MicroRNA與甲狀腺癌發生、發展關系的研究進展[J].臨床與實驗病理學雜志，2015,31(7):794-798.

[3]Jikuzono T,Kawamoto M，Yoshitake H,et al. The miR-221/222 cluster,miR-10b and miR-92a are highly upregulated in metastatic minimally invasive follicular thyroid carcinoma[J]. Int J Oncol,2013，42(6):1858-68.

[4]Agretti P,Eerrariui E，Rago T,et al. MicroRNA expression profile helps to distinguish benign nodules from papillary thyroid carcicomas starting from cells of fine-needle aspiration[J]. Eur J Eudocriuol,2012,167(3):393-400.

[5]Fernandes VT,de Santis RJ,Enepekides DJ,et al. Surgeon-performed ultrasound guided fine-needle aspirate biopsy with report of learning curve; a consecutive case-series study[J]. J Otolaryngol Head Neck Surg,2015,28(10):42-44.

[6]譚廣謀，廖衛國，陳偉泉，等.超聲引導穿刺組織病理學檢查對甲狀腺結節診斷價值的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2015,26(2):143-146.

[7]Ugurluoglu C,Dobur F,Karabagli P,et al. Fine needle aspiration biopsy of thyroid nodules:cytologic and histopathologic correlation of 1096 patients[J]. Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14800-14805.

[8]楊冬雪.超聲引導下粗針穿刺活檢在甲狀腺疾病診斷中的臨床應用價值[J].海軍醫學雜志，2015,27(1):8-9.

[9]李拓，劉志民.甲狀腺結節診斷方法的研究進展[J].臨床薈萃，2013,28(4)：460-463.

[10]盧秀波,賈勐,劉洋，等.微小RNA-221在甲狀腺乳頭狀癌細胞中的作用[J].中華實驗外科雜志，2012,29(10)：1981-1982.

[11]Yang Z,Yuan Z,Pan Y,et al. Integrated analyses of microRNA and mRNA expression profiles in aggressive papillary thyroid carcinoma[J]. Mol Med Rep,2013,8(5):1353-1358.

[12]Sun C，Li N,Zhou B,et al. miR-222 is upregulated in epithelial ovarian cancer and cell proliferation by down regulating P27[J]. Oncol Lett,2013，6(2):507-512.

[13]Fassina A,Cappellesso R,Simonato F,et al. A 4-MicroRNA signature can discriminate primary lymphomas from anaplastic carcinomas in thyroid cytology smears[J]. Cancer Cytopathol, 2014，122(4):274-281.

[14]Mardente S,Mari E,Massimi I,et al. HMGB1-Induced Cross Talk between PTEN and miRs 221/222 in Thyroid Cancer[J]. Biomed Res Int,2015，2015：512027.

[15]Pandhare-Dash J,Mantri CK,Gong Y, et al. XMRV accelerates cellular proliferation, transformational activity, and invasiveness of prostate cancer cells by downregulating p27(Kip1)[J]. Prostate,2012,72(8):886-897.

(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2016-01-25；[修回日期]2016-02-17

[作者簡介]冀宏(1981-),女,河北棗強人，河北醫科大學第二醫院主治醫師，醫學碩士，從事甲狀腺、乳腺外科疾病診治研究。 *通訊作者。E-mail:aining1@163.com

[中圖分類號]R736.1

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)05-0540-04

Expression and significance of miR-221 in patients with thyroid diseases

JI Hong, DI Wang, YAN Li, ZHANG Lin-lei, LI Qing-huai*

(Department of Thyroid Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017, China )

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of miR-221 in biopsy tissue of thyroid disease and peripheral blood. MethodsSpecimens were obtained by ultrasound guided core-needle in 51 cases of patients diagnosed with thyroid nodules. Peripheral blood samples were collected before operation. Quantitative PCR method was used to detect the expression of miR-221 levels in tissue and plasma. ResultsThe difference of the expression of miR-221 in benign lesions and normal tissue was not statistically significant(P>0.05). In thyroid cancer cases, miR-221 expression level in cancerous tissue were significantly higher than that in normal tissue adjacent to thyroid leisions(P<0.05). There were significant differences in the expression of miR-221 in different pathological stages of thyroid carcinoma and in lymph node metastasis(P<0.05). The level of miR-221 in peripheral blood of patients with thyroid cancer was significantly higher than that in healthy control group and in benign thyroid disease group(P<0.05). ConclusionThe high expression of miR-221 is closely related to the progression of thyroid carcinoma., which can provide novel ideas with preoperative diagnosis and individualized treatment for thyroid cancer.

[Key words]thyroid neoplasms； polymerase chain reaction； biopsy, needle