旋覆花內酯通過抑制炎癥反應對缺血腦組織發揮保護作用

溫　雅，董立鵬，趙景茹，祝春華

(河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000)

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·論著·

旋覆花內酯通過抑制炎癥反應對缺血腦組織發揮保護作用

溫雅，董立鵬，趙景茹，祝春華

(河北醫科大學第二醫院神經內科，河北 石家莊 050000)

[摘要]目的探討旋覆花內酯(Acetylbritannilactone，ABL)通過抑制炎癥反應對小鼠缺血性腦組織發揮保護作用及其機制。方法線栓法建立CD1小鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。實驗分為假手術組、MCAO組、ABL小劑量組(10 mg/kg)和ABL大劑量組(30 mg/kg)。ABL于術前30 min腹腔注射，術后24 h后處死小鼠。各組取材前進行神經功能評分，分別用Western blotting和RT-PCR的方法檢測缺血腦組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR4)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis receptor associated factor 6,TRAF6)和核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)蛋白和基因水平的變化，并觀察神經功能、腦水腫程度和腦梗死體積。結果與假手術組比較，MCAO組TNF-α、IL-1β、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白和基因表達水平明顯升高(P<0.05)；ABL能夠顯著下調炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達，降低TLR4、TRAF6和NF-κB的水平(P<0.05)，明顯改善神經功能、減輕腦水腫、減小梗死體積(P<0.05)。結論ABL通過抑制腦缺血引發的TLR4/TRAF6/NF-κB級聯途徑減少TNF-α、IL-1β的表達，發揮對缺血腦組織的抗炎作用，同時改善了腦缺血后小鼠神經功能缺損，減輕腦水腫，減小梗死體積，起到神經保護作用。

[關鍵詞]腦缺血;炎癥;旋履花內酯;小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.001

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，在世界范圍內，是成人的第3大死亡原因，致殘的首位原因。缺血后的繼發性腦損傷是患者病情加重和影響預后的重要原因，導致繼發性腦損傷的病理機制主要包括炎癥反應、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、自由基形成等。這幾種因素之間相互作用，構成復雜的調控網絡，導致一系列病理級聯反應，其中炎癥反應是繼發性腦損傷的最重要原因之一[1-2]。在缺血性腦損傷中，從受損的腦組織、血管和壞死細胞中釋放細胞因子，激活Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)，誘導炎性細胞因子，如白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的合成與釋放[3-4]。這些細胞因子引起腦缺血后的炎癥反應，進一步加重原發性腦損傷。TLRs/核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)信號通路在促進炎癥反應中發揮重要作用，激活TLRs能夠誘導下游轉錄因子NF-κB的激活，并誘導炎癥相關分子和細胞因子的基因轉錄[5-6]。旋覆花內酯(Acetylbritannilactone，ABL)是經二氧化碳超臨界萃取、系統分離得到的具有抗炎活性的單體化合物，已經證實其在巨噬細胞和血管平滑肌細胞中表現出強有力的抗炎和抗增殖作用[7-8]。而ABL在腦缺血中的的作用及機制有待明確。本研究通過建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO，MCAO)模型，觀察ABL對腦缺血后炎癥因子表達的影響，探討其對缺血性腦組織的保護作用及機制。

1　材料與方法

1.1動物和試劑

1.1.1實驗動物成年雄性健康清潔級CD1小鼠136只，體質量25～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物實驗均參照中華人民共和國科學技術部頒布的《實驗動物管理條例》執行，并通過倫理委員會批準。

1.1.2試劑和儀器兔抗TNF-α多克隆抗體(美國Abcam公司)；兔抗IL-1β多克隆抗體(美國Abcam公司)；兔抗核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)多克隆抗體(美國Cell signaling公司)；兔抗TLR4多克隆抗體(美國CABGENT公司)；兔抗腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis receptor associated factor 6,TRAF6)多克隆抗體(美國Bioworld公司)；DYY-12型電泳儀(北京 六一儀器廠)；Synergy-HT多功能酶標儀(美國Bio-Tek)；PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.1.3引物設計與合成上海生物工程公司合成，引物序列如下。TNF-α：上游5′-CACCACCATCA-AGGACTCAA-3′，下游5′-AGGCAACCTGACCA-CTCTCC-3′；IL-1β：上游5′-GCAACTGTTCCTG-AACTCAACT-3′，下游5′-ATCTTTTGGGGTCC-GTCAACT-3′；NF-κB：上游5′-ACAGACCCAGG-AGTGTTCACAGA-3′，下游5′-CATGGACACAC-CCTGGTTCAG-3′；TLR-4：上游5′-CTCACAG-ATAGCCTGGCCAATC-3′，下游5′-CCATCTCA-CAAGGCATGTCCAG-3′；TRAF6：上游 5′-TGG-ATTCTACACAGGCAGACC-3′，下游 5′-TCA-AAGCGGGTAGAGACTTCA-3′；GAPDH：上游5′-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3′，下游5′-TG-TCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3′。

1.2方法

1.2.1分組和模型線栓法建立永久性小鼠右側MCAO模型[9]。隨機將136只CD1小鼠分為假手術組、MCAO組、ABL小劑量(ABL-L)組、ABL大劑量(ABL-H)組。假手術組血管分離后不插線栓。ABL干預組分別以10 mg/kg和30 mg/kg，于MCAO術前30 min腹腔注射。

1.2.2神經功能缺失評分MCAO術后24 h，采用改良的Longa分級法進行行為學評分：0分，無神經功能損傷癥狀；1分，提尾時不能完全伸展對側前肢；2分，對側前肢屈曲；3分，行走時向癱瘓側轉圈；4分，行走時向癱瘓側跌倒；5分，不能自發行走，意識喪失。

1.2.3腦組織含水量測定小鼠在手術后24 h斷頭，迅速取腦。冠狀切開去除額極，雙側取約2 mm厚的腦組織，采用干濕法測定腦含水量：(腦組織濕質重-腦組織干質量)/濕質重×100%。

1.2.4腦梗死體積測定各組小鼠在相應時間斷頭取腦，均勻切成5片冠狀切片，浸入2% TTC溶液，37 ℃孵育15 min，染上顏色后取出置于4 %多聚甲醛中固定24 h。梗死體積百分比={[總梗死體積-(梗死同側半球總體積-梗死對側半球總體積)]/梗死對側半球體積} ×100%。

1.2.5腦缺血后炎癥因子的表達及TLR4/TRAF6/NF-κB級聯途徑中相關因子的檢測采用Western blotting和RT-PCR檢測腦組織中炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β，以及NF-κB、TLR-4和TRAF6的表達。

1.3統計學方法應用SPSS 13.0統計軟件處理數據。計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗。神經功能評分比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1各組小鼠腦缺血后的神經功能缺損比較與假手術組相比，其他3組神經功能評分均顯著升高(P<0.05)，即有明顯的神經功能障礙。ABL-H組神經功能評分得到明顯改善(P<0.05)，但ABL-L組與MCAO組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　4組神經功能評分比較

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05與MCAO組比較(秩和檢驗)

2.2各組局灶性腦缺血損傷后的腦水腫比較術后24 h，與假手術組相比，其他3組小鼠病變側腦組織含水量明顯升高(P<0.05)。ABL處理后，與MCAO組相比，ABL-H組在24 h觀察發現病變側腦組織含水量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；而ABL-L組腦組織含水量與MCAO組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表24組術后24 h腦組織含水量比較

組別腦組織含水量假手術組 77.87±0.98MCAO組85.08±1.13*ABL-L組84.75±1.09*ABL-H組82.41±1.15*#F 55.875P <0.01

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05 與MCAO組比較(q檢驗)

2.3各組局灶性腦缺血損傷后的梗死體積比較通過TTC染色法測定腦梗死體積。假手術組小鼠腦組織表現為均勻一致的紅色，而MCAO組則出現大范圍蒼白色梗死區域。ABL處理后，大、小2個劑量組蒼白色梗死區域體積均顯著縮小(P<0.05)，提示ABL能夠減輕局灶性腦缺血后的梗死體積，從而發揮腦保護作用。見表3。

表34組術后24 h腦梗死體積比較

組別梗死體積百分比假手術組 0.00±0.00MCAO組55.21±2.14ABL-L組41.50±1.48*ABL-H組26.60±1.77*F 3949.932P <0.05

*P<0.05與MCAO組比較(q檢驗)

2.4ABL下調炎癥細胞因子的表達Western blotting和RT-PCR結果顯示，與假手術組比較，MCAO組TNF-α和IL-1β蛋白和基因均表達明顯升高(P<0.05)，而不同劑量ABL組均能降低TNF-α和IL-1β蛋白和基因的表達(P<0.05)，其中ABL-H組更為明顯。見表4,5。

表4ABL降低TNF-α、IL-1β的蛋白表達

組別TNF-αIL-1β假手術組 0.52±0.060.56±0.07MCAO組1.06±0.15*1.63±0.25*ABL-L組0.47±0.05#0.79±0.08#ABL-H組0.31±0.04#0.41±0.03#F 84.39795.280P <0.01<0.01

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05與MCAO組比較(q檢驗)

表5ABL降低TNF-α、IL-1β的基因表達

組別TNF-αIL-1β假手術組 1.12±0.121.06±0.09MCAO組1.58±0.21*1.87±0.28*ABL-L組0.79±0.09#1.35±0.11#ABL-H組0.45±0.06#0.72±0.07#F 79.37354.987P <0.01<0.01

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05與MCAO 組比較(q檢驗)

2.5ABL降低TLR4、TRAF6及核NF-κB的表達通過Western blotting和RT-PCR檢測缺血腦組織TLR4、TRAF6及核NF-κB蛋白和mRNA表達水平，評價ABL對TLR4/TRAF6/NF-κB炎性信號通路的影響。腦缺血24h后，MCAO組TLR-4、TRAF6及NF-κB水平明顯升高(P<0.05)，而ABL處理后，TLR-4、TRAF6及NF-κB的表達水平顯著下降(P<0.05)。見表6,7。

表6ABL降低TLR-4、TRAF6及NF-κB的蛋白表達

組別TLR-4TRAF6NF-κB假手術組 0.52±0.060.24±0.020.56±0.07MCAO組1.10±0.11*0.68±0.06*1.15±0.09*ABL-L組0.61±0.05#0.33±0.04#0.67±0.06#ABL-H組0.58±0.07#0.39±0.03#0.59±0.05#F 74.416133.66295.445P <0.01<0.01<0.01

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05與MCAO組比較(q檢驗)

表7ABL降低TLR-4、TRAF6及NF-κB的基因表達

組別TLR-4TRAF6NF-κB假手術組 1.07±0.091.00±0.011.03±0.06MCAO組5.11±0.35*2.68±0.31*4.26±0.42*ABL-L組2.76±0.07#1.79±0.12#1.90±0.25#ABL-H組2.11±0.08#1.33±0.17#1.35±0.21#F 496.18591.493178.872P <0.01<0.01<0.01

*P<0.05與假手術組比較#P<0.05與MCAO組比較(q檢驗)

3　討　　論

腦梗死后缺血損傷的病理生理學機制非常復雜，主要涉及炎癥、氧化應激、自由基損傷、鈣超載和神經元凋亡等多個環節，各個環節相互作用，相互影響，構成復雜的級聯損傷。其中過度的炎癥反應存在于腦梗死后組織壞死及缺血區域，導致炎性損傷已成共識，本實驗室的前期研究亦證實了這一點[10-11]。炎癥反應的發生由促炎因子的活化引發，如TNF-α、IL-1β和白細胞介素6，改變血流量，增加血管通透性，從而引起繼發性缺血，加重腦損傷[12]。TNF-α作為一個重要的促炎細胞因子，無論是在永久性還是在缺血-再灌注大腦中動脈閉塞模型中都是顯著升高的[13]。IL-1β是白細胞介素家族重要促炎細胞因子，與卒中密切相關。在MCAO模型中，增加TNF-α和IL-1β表達則會導致腦梗死體積擴大及神經元死亡[14]。

TLRs是IL-1受體超家族高度保守成員之一，有證據表明，TLRs被腦組織損傷釋放的內源性損傷相關分子模式激活，在介導腦缺血后繼發性損傷中發揮重要作用[15]。TLR4被激活后，招募下一個信號蛋白IL-1受體相關激酶，導致其自身磷酸化[16]，磷酸化的IRAKs脫落下來并與TRAF6結合形成復合物，并使TAB1、TAB2磷酸化。TRAF6自身泛素化，通過NF-κB誘導激酶活化作用，并形成活化的IκB激酶復合體，最終IκB泛素化降解，NF-κB由與IκB結合所處的靜息態轉變為激活狀態，游離的NF-κB轉移到胞核[17]。

ABL是經二氧化碳超臨界萃取、系統分離得到的具有抗炎活性的單體化合物，化學結構屬于苯并呋喃酮衍生物，是一種極具開發前景的抗炎新藥。目前在血管內皮細胞及血管平滑肌細胞中有較為深入的研究，證實ABL對促炎基因[包括環氧合酶(cyclooxygenase,COX-2)、iNOS]和細胞黏附分子基因(包括VCAM-1、ICAM-1、MMP-9和黏蛋白C)表達均具有顯著抑制作用，從而明顯減輕炎癥介質的合成、釋放及血管炎性反應[7-8]。此外，ABL能夠抑制血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)誘導的DNA合成和細胞增殖，導致增殖血管平滑肌細胞的凋亡[18]。近來，在神經系統變性疾病如阿爾茨海默病中研究發現，ABL能明顯抑制NF-κB的表達，從而抑制COX-2表達，抑制炎癥反應，改善癡呆大鼠的學習記憶障礙[19]。而ABL在腦缺血中的作用目前研究較少。

本研究結果顯示，ABL可改善局灶性腦缺血損傷后小鼠神經功能缺損，減輕腦水腫，減小梗死體積，起到神經保護作用。其機制可能是通過抑制腦缺血引發的TLR4/TRAF6/NF-κB信號級聯減少TNF-α、IL-1β的表達，發揮對腦缺血損傷的抗炎作用。但ABL通過何種因子或途徑影響上述通路，以

及是否還通過其他作用機制起到抗炎作用，仍需進一步深入研究。

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(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2015-12-28；[修回日期]2016-01-08

[作者簡介]溫雅(1981-)，女，河北石家莊人，河北醫科大學第

[中圖分類號]R743.31

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)05-0497-05

Acetylbritannilactone exerts the neuroprotective effect on ischemic cerebral tissues by inhibiting the inflammatory responses

WEN Ya, DONG Li-peng, ZHAO Jing-ru, ZHU Chun-hua

(Department of Neurology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)

【Abstract】ObjectiveThis study is to explore the protective role and mechanism of Acetylbritannilactone(ABL) on inflammatory responses induced by focal cerebral ischemia in mice. MethodsMale CD1 mice were subjected to permanent middle cerebral artery occlusion(MCAO). The mice were randomly divided into sham-operated group, MCAO group, ABL-L group(10 mg/kg) and ABL-H group(30 mg/kg). ABL was injected intraperitoneally 30 minutes prior to MCAO operation. Mice were anesthetized and sacrificed at 24 h after stroke. Western blotting and RT-PCR were used to examine the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), Toll-like receptor 4(TLR4), tumor necrosis receptor associated factor 6(TRAF6) and nuclear factor-kappa B(NF-κB). And the neurological deficit scores, brain water content and infarct volume were explored. ResultsCompared to sham group, the expressions of TNF-α, IL-1β, TLR-4, TRAF6 and NF-κB were significantly increased in MCAO group(P<0.05). ABL treatment markedly down-regulated expressions of TNF-α, IL-1β, TLR4, TRAF6, and NF-κB(P<0.05). The neurological deficit scores, infarct volume and brain water content were alleviated compared to MCAO group(P<0.05). ConclusionABL treatment effectively ameliorates neurological defect, brain edema and brain infarct volume. ABL decreases inflammatory responses by suppressing the expression of the proinflammatory signaling molecules TLR4, TRAF6 and NF-κB, inhibiting TNF-α and IL-1β expression in ischemic cerebral tissue of MCAO mice.

[Key words]brain ischemia； inflammation； Acetylbritannilactone; mice

二醫院主治醫師，醫學博士，從事腦血管疾病診治研究。