miRNA-206 靶向細胞周期蛋白D2調控神經膠質瘤細胞增殖

黃佳佳　張官嫦　譚　娜　楊曉榮　張蘇園　姚　晉　鄭　洪

(遵義醫學院附屬醫院病理科，貴州　遵義　563003)

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miRNA-206 靶向細胞周期蛋白D2調控神經膠質瘤細胞增殖

黃佳佳張官嫦1譚娜楊曉榮張蘇園姚晉鄭洪

(遵義醫學院附屬醫院病理科，貴州遵義563003)

目的探討miRNA-206在神經膠質瘤組織中的表達及其對神經膠質瘤細胞增殖的影響。方法采用熒光定量PCR方法檢測神經膠質瘤組織和細胞系中miRNA-206 的表達情況；通過四甲基偶氮唑藍比色(MTT)增殖實驗檢測miRNA-206對神經膠質瘤細胞T98G增殖的影響；生物信息學方法預測miRNA-206可能的靶基因，并采用熒光素酶報告基因實驗驗證預測的細胞周期蛋白D2(CCND2)是miRNA-206的靶基因；蛋白質印跡方法檢測miRNA-206對CCND2表達的影響。結果miRNA-206在神經膠質瘤組織中的表達顯著降低(P<0.01)，且神經膠質瘤惡性度越高，miRNA-206的表達越低(P<0.01)；同時，神經膠質瘤細胞系中miRNA-206的表達亦顯著降低(P<0.01)；轉染miRNA-206 mimics上調神經膠質瘤細胞T98G中miRNA-206表達后可顯著抑制神經膠質瘤細胞T98G的增殖能力(P<0.01)，而轉染anti-miRNA-206可增加神經膠質瘤細胞T98G的增殖能力(P<0.01)。通過TargetScan軟件進行生物信息學預測顯示CCND2為miRNA-206的功能性靶基因，且得到熒光素報告實驗結果證實。蛋白質印跡結果顯示轉染miRNA-206可顯著抑制神經膠質瘤細胞T98G中CCND2的表達。結論miRNA-206可通過調節CCND2的表達，進而抑制神經膠質瘤細胞T98G的增殖能力，神經膠質瘤組織中miRNA-206的低表達與神經膠質瘤的發生發展密切相關。

miRNA-206；神經膠質瘤；細胞周期蛋白D2

miRNA-206在多種腫瘤組織中存在異常表達，且與多種腫瘤的發生發展密切相關〔1,2〕。然而，關于miRNA-206在神經膠質瘤組織中的表達及其與神經膠質瘤發生發展的關系目前還很少有文獻報道。本研究旨在探討miRNA-206對細胞周期蛋白D2(CCND2)蛋白表達水平的影響及其調控神經膠質瘤進展的作用及相關機制。

1　材料與方法

1.1臨床資料收集2012年1月至2014年1月于我院進行神經膠質瘤切除術的腫瘤及癌旁標本50例，均經病理證實為神經膠質瘤。年齡33～70〔平均(48.78±14.48)〕歲。根據WHO神經系統腫瘤分類標準進行病理分級。獲取標本后迅速保存于液氮中。所有患者術前均未接受化療和放療。

1.2神經膠質瘤細胞系神經膠質瘤細胞系A172、U87MG、T98G、293ET和PC-3購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，均培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的CO2孵箱中進行培養。待細胞生長至對數生長期開始實驗。

1.3主要試劑胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養基購自Hyclone公司；轉染試劑Lipofectamine2000、TRIzol、miRNA-206 mimics、陰性對照(NC)、anti-miRNA-NC和anti-miRNA-206購自Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒購自Roche公司；熒光素酶檢測試劑盒購自碧云天公司；CCND2抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自Santa Cruz公司。

1.4Trizol法的熒光定量PCR提取神經膠質瘤細胞總RNA，并反轉錄成cDNA。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 50 s，共30個循環。引物序列：miR-206上游引物：5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'，下游引物：5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'；內參對照U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。通過CT值法對得到的數據進行定量分析。

1.5細胞轉染神經膠質瘤細胞傳代至對數生長期并長至70%融合時開始進行轉染實驗。嚴格按照Lipofectamine2000試劑盒的說明書進行轉染實驗的相關操作，并在轉染48 h后用于功能實驗。

1.6四甲基偶氮唑藍比色(MTT)增殖實驗實驗用細胞培養至對數生長期，接種于96孔培養板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下作用4 h后吸出上清，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速震蕩混勻10 min后，波長490 nm處測定OD值。

1.7生物信息學方法預測miRNA-206靶基因通過靶基因預測軟件TargetScans篩選出CCND2作為miRNA-206的靶基因。

1.8熒光素酶報告基因驗證靶基因Targetscan靶基因預測軟件檢測結果提示CCND2 mRNA的3'非翻譯區(3'UTR)的1177-1183位點是miRNA-206的可能結合位點(BS)，體外合成含該位點的DNA片段及含該位點突變體的 DNA片段，克隆至雙熒光素酶啟動子載體pMIR，并共同轉染至肺癌細胞中，培養48 h后，采用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9Western印跡具體操作方法可參見文獻報道〔3〕。至少重復3次所有實驗。

1.10統計學方法應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1miRNA-206在神經膠質瘤組織和細胞系中的表達情況miRNA-206在神經膠質瘤組織中的表達較正常對照組織顯著降低(P<0.01)，且神經膠質瘤惡性度越高，miRNA-206的表達越低(P<0.01)；miRNA-206在5種神經膠質瘤細胞系中的表達亦顯著降低(P<0.01)。

2.2miRNA-206對神經膠質瘤細胞U87MG增殖的影響轉染miRNA-206 mimics可顯著抑制神經膠質瘤細胞U87MG的增殖能力(P<0.01)，而轉染anti-miRNA-206可增加神經膠質瘤細胞U87MG的增殖能力(P<0.01)。見圖1。

2.3TargetScan預測miRNA-206靶基因通過CCND2可能為miRNA-206的功能性靶基因。miRNA-206預測結合CCND2 3'-UTR的靶位點如圖2所示。為確定miRNA-206是否和CCND2存在直接的相互作用，構建含野生型和突變型CCND2的3'-UTR序列的pMIR載體。結果顯示，共轉染野生型pMIR-CCND2 3'-UTR載體和miRNA-206的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而共轉染突變型pMIR-CCND2 3'-UTR載體和miRNA-206的熒光素酶活性未出現顯著降低。

2.4miRNA-206對神經膠質瘤細胞T98G中CCND2表達的影響轉染miRNA-206 mimics可顯著抑制神經膠質瘤細胞U87MG中CCND2的表達，而轉染miRNA-206抑制劑可增加神經膠質瘤細胞U87MG中CCND2的表達。見圖3。

圖1　miRNA-206對神經膠質瘤細胞T98G增殖影響檢測

圖2　TargetScans靶基因預測軟件預測miRNA-206靶基因

圖3　miRNA-206對神經膠質瘤細胞T98G中CCND2表達影響檢測

3　討　論

miRNA作為一類非編碼小的RNAs，其長度約為19～25個核苷酸。近年來的相關文獻研究的結果均證實miRNA對人類癌癥的進展具有十分重要的作用〔3,4〕。Yunqiao等〔5〕證實miRNA-206在肝癌組織和細胞系中的表達均顯著降低，過表達miRNA-206可抑制胃癌細胞系的增殖，并促進胃癌細胞系的凋亡；Chen等〔6〕研究結果同樣證實miRNA-206具有抑制子宮內膜樣腺癌細胞的增殖和侵襲能力。然而關于miRNA-206在神經膠質瘤進展中的作用及相關機制尚未研究清楚。本研究結果與上述研究結果一致。

miRNAs發揮作用主要通過下游的靶基因。G1細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復合物與哺乳動物細胞的細胞周期調控密切相關〔7〕，其過度表達會導致腫瘤的發生和發展。因此，在多種癌癥中均存在CCND2水平的升高〔8,9〕，導致腫瘤細胞無限制的增殖，從而導致腫瘤的發生和發展。本研究結果提示可能是CCND2的表達被miRNA-206所調節而抑制神經膠質瘤細胞的增殖能力?？傊甿iRNA-206通過調控CCND2進而抑制神經膠質瘤細胞的增殖能力。此外，在神經膠質瘤治療中，miRNA-206可作為一種潛在的治療靶點。

1Zhou J,Tian Y,Li J,etal.miR-206 is down-regulated in breast cancer and inhibits cell proliferation through the up-regulation of cyclinD2〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;433(2):207-12.

2Zhang L,Liu X,Jin H,etal.miR-206 inhibits gastric cancer proliferation in part by repressing cyclinD2〔J〕.Cancer Lett,2013;332(1):94-101.

3Zhang Y,Zheng D,Xiong Y,etal.miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally〔J〕.FEBS Lett,2014;588(10):1913-20.

4Hong L,Han Y,Yang J,etal.MicroRNAs in gastrointestinal cancer:prognostic significance and potential role in chemoresistance〔J〕.Expert Opin Biol Ther,2014;14(8):1103-11.

5Yunqiao L,Vanke H,Jun X,etal.MicroRNA-206,down-regulated in hepatocellular carcinoma,suppresses cell proliferation and promotes apoptosis〔J〕.Hepato-gastroenterol,2014;61(133):1302-7.

6Chen X,Yan Q,Li S,etal.Expression of the tumor suppressor miR-206 is associated with cellular proliferative inhibition and impairs invasion in ERα-positive endometrioid adenocarcinoma〔J〕.Cancer Lett,2012;314(1):41-53.

7Kshaunis M,Subhabrata P,Rita K.Induction of apoptosis in G1/S blocked hela cells by r-roscovitine:a preliminary study〔J〕.Proceed Zoolog Soc,2014;67(2):114-25.

8Mermelshtein A,Gerson A,Walfisch S,etal.Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas〔J〕.Br J Cancer,2005;93(3):338-45.

9Dong Q,Meng P,Wang T,etal.MicroRNA let-7a inhibits proliferation of human prostate cancer cells in vitro and in vivo by targeting E2F2 and CCND2〔J〕.PLoS One,2010;5(4):e10147.

〔2015-12-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.025

黃佳佳(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事分子病理研究。

R730.264

A

1005-9202(2016)14-3409-02；

1茅臺集團職工醫院