Lipofectamine2000轉染pSiRNA-STAT3質粒對腦神經膠質瘤C6細胞的作用

周翔宇　田　琳　周　悅　戴　樂　劉　爽　周慶偉

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院，吉林　長春　130033)

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Lipofectamine2000轉染pSiRNA-STAT3質粒對腦神經膠質瘤C6細胞的作用

周翔宇田琳1周悅2戴樂劉爽1周慶偉1

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院，吉林長春130033)

目的研究Lipofectamine2000下轉染pSiRNA-STAT3質粒對腦神經細胞C6的作用。方法取對數生長期的C6細胞隨機分為Mack組、Scramble組和pSiRNA-STAT3組采用MTT法檢測C6細胞在不同時間段(6、8、10 h)細胞增殖活性；熒光顯微鏡觀察吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)檢測細胞凋亡及線粒體膜電位變化。結果Lipo2000轉染pSiRNA-STAT3質粒在8 h時對C6細胞具有明顯的抑制作用；鏡下觀察pSiRNA-STAT3組可見典型的細胞凋亡形態(tài)學特征性改變；線粒體膜電位顯著降低。Mock組與Scramble組比較無統計學意義(P>0.05)；pSiRNA-STAT3組與Scramble組比較差異顯著(P<0.05)。結論Lipo2000 轉染pSiRNA-STAT3質粒可能通過降低線粒體膜電位，抑制腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤生長的作用。

pSiRNA-STAT3質粒；神經膠質瘤C6細胞；細胞凋亡；線粒體膜電位

神經膠質瘤的發(fā)病機制尚未十分清楚，研究顯示，神經膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡密切相關〔1～3〕。傳統的治療原則是術后先放療后化療或單獨放療/化療，但都難以提高其臨床療效〔4〕。研究已證明，利用小干擾 RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或小分子抑制劑調低 STAT3蛋白的表達具有抗腫瘤作用〔5～7〕。因此，STAT3可作為惡性腫瘤的預后指標和治療靶點。本實驗旨在研究Lipofectamine 2000 c Lipo2000,轉染pSiRNA-STAT3質粒對腦神經膠質瘤C6細胞作用的影響。

1　材料與方法

1.1材料腦神經膠質C6細胞株：購自中國科學院上海細胞生物學研究所；主要試劑：①Opti-MEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司產品，編號：1267487)；②Lipofectamine2000轉染試劑(美國，編號：1345247，)；③線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，編號：C2006)。主要藥品：①溴乙啶(EB，美國Sigma公司，批號：E8751)；②吖啶橙(AO，中國北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：1AB10220)；③二甲基亞砜 、四甲基偶氮唑藍(MTT)均為美國Sigma公司產品。主要儀器：① 熒光顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i(日本尼康公司)；②二氧化碳培養(yǎng)箱(日本 三樣電機株式會社制造，型號：NCO-15AC)；③AN YANG超凈臺(中國 蘇州安洋科技發(fā)展有限公司，型號：BSC-BOOⅡB2)；④ 酶標儀(中國 上海BIO-RAD公司，型號：MODEL550)。

1.2方法

1.2.1Lipo2000 轉染pSiRNA-STAT3質粒濃度的配置設4個EP管，分別標記A、B、C、D，每管加入550 μl Opti培養(yǎng)基。A和B分別加入8.8 μl的pSiRNA-STAT3和Scramle質粒。C和D每管分別加入22 μl Lipo 2000轉染試劑，將上述C管與A管混合，D管和B管混合，混均后室溫放置20 min，取對數生長期的C6細胞隨機分為Mack組、Scramble組和pSiRNA-STAT3組分別向pSiRNA-STAT3和Scramble組加入上述配制的混合物，輕輕搖均，按不同實驗方法用藥。

1.2.2MTT比色法檢測細胞活力①取對數生長期C6細胞用0.25%胰酶消化，調整細胞懸液1×104/ml，每孔加入100 μl細胞懸液接種到96孔板，置于37℃，5%CO2下孵育；②隨機分為Mock、Scramble和pSiRNA-STAT3組，各設8個復孔，按分組給藥(參照方法1.2.1)；③檢測6、8、10 h細胞生長情況；④在實驗各時間點每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，孵育4 h，棄上清；加入DMSO 150 μl，置于震蕩儀震蕩10 min，使結晶充分溶解；⑤使用酶聯免疫儀檢測OD值，吸收波長設為490 nm。

1.2.3AO/EB雙染①細胞爬片：取對數生長期C6細胞用0.25%胰酶消化。調整細胞懸液3×105ml接種六孔板，37℃，5%CO2下孵育；②每組設2個復孔，按分組給藥(參照方法1.2.1)，每孔終體積2 ml。37℃，5%CO2下孵育8 h；③取出爬滿細胞的蓋玻片置于載玻片上，在蓋玻片上滴加AO和EB染液各5 μl，立即在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野拍照，取其均數計算細胞程序性凋亡率。

1.2.4線粒體膜電位檢測(JC-1)① 取對數生長期C6細胞用0.25%胰酶消化，細胞計數為3.0×105/ml，接種在6孔板，實驗設陽性空白對照組、Mock組、Scramble組及pSiRNA-STAT3組。每組設2個復孔，細胞貼壁后棄掉培養(yǎng)液；②加入無雙抗10%DMEM培養(yǎng)液，按分組給藥(方法參照1.2.1)，終體積為2 ml，置入37℃，5%CO2下孵育；③轉染8 h，陽性空白對照組每孔加入CCCP(CCCP按照1∶1 000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中)；Scramble與pSiRNA-STAT3組每孔加入0.5 ml JC-1染色工作液。37℃孵育20 min，棄掉上清液，用冰浴JC-1(1×)緩沖液沖洗細胞2次，每孔加入1 ml培養(yǎng)液；④熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長530 nm。隨機選取5個視野拍照，取其均數計算細胞程序性凋亡率。

1.3統計學方法采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1MTT法檢測細胞活性在6 h時，各實驗組之間抑制作用無統計學意義(P>0.05)。在8 h時，pSiRNA-STAT3組對C6細胞具有明顯的抑制作用，與Scramble比較有統計學意義(P<0.05)，在10 h時，各實驗組之間比較無統計學意義(P>0.05)。提示細胞生長10 h pSiRNA-STAT3對C6細胞生長無抑制作用。見表1及圖1。

2.2轉染pSiRNA-STAT3質粒對C6細胞雙染(AO/EB)熒光染色觀察細胞凋亡轉染pSiRNA-STAT3質粒作用于C6膠質瘤細胞8 h后用AO/EB染色在熒光顯微鏡下觀察。結果表明，Mock組可見大量被染成綠色的正常細胞，細胞呈梭形，胞核完整，界限清楚。pSiRNA-STAT3組綠色細胞數目逐漸減少，紅色凋亡細胞數目顯著增多，pSiRNA-STAT3組細胞凋亡率(0.34±0.04)與Mock組(0.12±0.03)及Scramble組(0.17±0.02)比較顯著性均具有統計學意義(P<0.05)，Mock組與Scramble組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

表1　pSiRNA-STAT3質粒對C6膠質瘤細胞增殖活性的影響(OD值，

與Scramble組比較:1)P<0.05

2.3轉染 pSiRNA-STAT3質粒對C6細胞線粒體膜電位變化的影響 熒光顯微鏡下可見：陽性空白對照組在CCCP處理20 min后呈綠色熒光，Mock組細胞狀態(tài)良好，呈紅色熒光，胞質著色深，可見少量凋亡細胞；Scramble組細胞狀態(tài)良好，可見許多分布均勻的紅色熒光，少許綠色熒光；pSiRNA-STAT3組可見許多綠色熒光，少許紅色熒光。 結果表明，pSiRNA-STAT3組(0.33±0.10)與Mock組(0.06±0.03)及Scramble組(0.13±0.03)比較差異均具有統計學意義(P<0.05)；Scramble組與Mock組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖1　pSiRNA-STAT3質粒對C6膠質瘤細胞增殖活性的影響(OD)值(×20)

圖2　轉染PsiRNA-STAT3質粒對C6細胞凋亡的影響(AO/EB)(×20)

圖3　轉染pSiRNA-STAT3質粒對C6細胞線粒體膜電位變化的影響(×20)

3　討　論

腦神經膠質瘤是中樞神經系統中最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，目前顱內腫瘤發(fā)生的病因尚未完全清楚，近些年來一些轉錄因子逐漸被發(fā)現，它們在調節(jié)腫瘤的相關基因方面起著重要作用。研究顯示，STAT3與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，STAT3 在惡性膠質瘤細胞中存在異常活化〔8〕。而且多數惡性腫瘤，如前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及骨髓瘤中均發(fā)現了STAT3 的異?；罨?，上述結果證實了腫瘤的發(fā)生與 STAT3 蛋白的異?；罨赡艽嬖谝欢ǖ南嚓P性。因此，致癌基因STAT3與腫瘤的研究成為熱點，其抑制劑被認為是一種潛在的抗腫瘤藥物〔9〕。已有研究證實，通過RNA干擾技術抑制STAT3后能夠減弱細胞的增殖〔10〕。這些發(fā)現使STAT3 成為腫瘤治療中的重要靶點。本實驗提示，pSiRNA-STAT3對C6細胞具有明顯的抑制作用，而且證實了Lipo2000轉染pSiRNA-STAT3質粒后在8 h時能夠明顯抑制C6腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡的作用。據文獻報道，正常情況下，JC-1是維持線粒體進行正常氧化磷酸化并產生三磷酸腺苷的必要條件可是保持線粒體正常功能。線粒體跨膜電位的消失是一個不可逆轉的細胞凋亡過程的標志。因此，可以認定線粒體跨膜電位的消失能夠較早的，并不可逆轉地決定了細胞凋亡的命運〔11〕。本研究顯示轉染pSiRNA-STAT3質?？赡苤苯幼饔糜贑6細胞線粒體，使線粒體膜通透性增加，跨膜電位下降，誘導細胞凋亡的發(fā)生，其誘導凋亡的分子機制可能與線粒體膜電位下降有關。

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11陳慧莉，李建華，王樹慶.線粒體跨膜電位和細胞凋亡相關性的研究〔J〕.醫(yī)學綜述，2007；13(14)：1041-3.

〔2016-02-19修回〕

(編輯郭菁)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.023

劉爽(1991-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤研究。

周翔宇(1992-)，男，在讀碩士，主要從事普外疾病研究。

R74

A

1005-9202(2016)14-3404-03；

1吉林大學藥學院2南京中醫(yī)藥大學藥學院