Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的表達及其作用機制

鄒慧娟　鄭　航　李明君　姜媛媛　張　利　張　洋　肖興國

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院感染性疾病科，河南　新鄉(xiāng)　453000)

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Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的表達及其作用機制

鄒慧娟鄭航1李明君2姜媛媛3張利3張洋3肖興國3

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院感染性疾病科，河南新鄉(xiāng)453000)

目的探討Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的表達及其相關的分子機制。方法用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測所有參與者(65例結(jié)腸癌和30例健康人)血清中半乳糖凝集素(galectin)-3的含量，觀察galectin-3和人結(jié)腸癌發(fā)病的關系，熒光實時定量PCR檢測人結(jié)腸癌組織和癌旁組織中相關基因的表達。Western印跡檢測人結(jié)腸癌組織和癌旁組織中相關蛋白的表達水平，包括軸蛋白基因(AXIN)、β-catenin，c-myc和cyclin D1蛋白。結(jié)果血清中的galectin-3水平在結(jié)腸癌Ⅲ期患者血清中的含量較健康對照組明顯升高(P<0.01)。結(jié)腸癌組織中AXIN mRNA表達水平下降，β-catenin mRNA表達水平不變但其下游分子c-myc和cyclin D1基因的表達水平升高。β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白水平均升高，Wnt信號通路明顯激活。結(jié)論在結(jié)腸癌患者血清中g(shù)alectin-3水平明顯升高，AXIN表達水平降低，其可以活化Wnt信號通路，激活后的Wnt信號通路通過β-catenin上調(diào)細胞增殖相關因子c-myc和cyclinD1水平的升高，促進結(jié)腸癌細胞的增殖。

結(jié)腸癌；Wnt信號通路；c-myc；cyclinD1

Dsh蛋白可導致β-catenin在細胞內(nèi)聚積并轉(zhuǎn)至細胞核內(nèi)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子(Tcf/LEF)家族，上調(diào)c-myc和cyclin D1基因的表達，促進細胞的增殖和分化〔1～3〕。血清半乳糖凝集素-3(galectin-3)通過結(jié)合細胞外基質(zhì)以及細胞表面的多聚體復合物，經(jīng)過細胞的信號轉(zhuǎn)導，最終達到抑制細胞增殖的作用〔4，5〕。研究發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者體內(nèi)galectin-3的水平明顯升高〔6〕。軸蛋白基因(AXIN)是Wnt信號通路的重要負性調(diào)控因子，其通過參與組裝β-catenin干擾復合物抑制Wnt信號通路的進行，進而下調(diào)Wnt和β-catenin靶基因的表達。在許多癌癥組織基因的表達譜中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞核內(nèi)AXIN基因多發(fā)生缺失突變，核內(nèi)β-catenin的水平升高〔7〕。但是Wnt信號通路在結(jié)腸癌中的表達及其作用機制目前尚不清楚，本文就此探究 Wnt信號通路與結(jié)腸癌的機制。

1　材料與方法

1.1病例選取2013年8月至2015年8月在我院住院的結(jié)腸癌病人65例，其中男35例，女30例，年齡32～67〔平均(43.22±10.55)〕歲。均經(jīng)過活檢和病理診斷分級，其中腫瘤的分期和分級參照美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)頒布的結(jié)直腸癌的腫瘤分期和分級標準，所有入組者的腫瘤組織均為術(shù)后標本，具體病理分期為Ⅲ期。所有患者均為首發(fā)結(jié)腸癌，病情穩(wěn)定，未接受過放射治療和化學治療，無合并腫瘤出血、腸穿孔、腸梗阻、急慢性感染。手術(shù)病人腫瘤組織的癌旁組織作為對照組。另外選取30名健康志愿者作為健康對照組，于早晨空腹時抽血。向所有入組者說明取組織的目的和研究的性質(zhì)，并簽署知情同意書，該研究方案已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會審批。所有參與者于早晨空腹時候抽血約4 ml，分離血清，血清和組織均于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)檢測。

1.2材料和試劑人galectin-3酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；RIPA裂解液(碧云天)，蛋白酶抑制劑(PMSF，碧云天)，組織樣品研磨機(上海凈信科技)；AXIN抗體、beta-catenin抗體、actin抗體均購自上海銀海圣生物科技有限公司。SYBR green(羅氏)，熒光實時定量PCR儀(Applied Bio-systems公司)；Trizol(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)。

1.3ELISA 檢測血清中g(shù)alectin-3含量所有參與者血清中g(shù)alectin-3的含量均采用ELISA法檢測，檢測原理雙抗體夾心法，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算人血清中g(shù)alectin-3的含量。

1.4熒光實時定量PCR檢測相關基因的表達選取3名具有代表性的結(jié)腸癌患者的癌組織，并以癌旁相對正常的組織作為對照，分別稱取10 g癌組織和癌旁組織，加入Trizol裂解液后用組織研磨機磨碎，按照Invitrogen公司的操作方法提取組織中的RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA，利用熒光實時定量PCR儀檢測相關基因的表達。引物序列：Axin正向:CGCAGGTTCTTGGTCACTGT，反向：TGTTCACGAAAGCCAGAGCG；β-catenin正向：GCTCAACTACGGTGCAGATTC，反向：GCACGATGTCTTGATGTCCC；c-myc正向：ACATCAAGACATCGTGCGATATT，反向：CCAGCGGTACACAAAGACCA；cyclin D1正向：AACTCTTTCGGTCGTACCCCC，反向：GCGTGCTTGAGCTGAAGCTA；actin正向：AGGGGAGAGCGGGTAAGAGA，反向：AGTAGGAGAGAGCGAGCGACC。

1.5Western印跡檢測癌組織相關蛋白的表達水平選取和熒光實時定量PCR檢測同樣的3名結(jié)腸癌患者的癌組織，并以癌旁相對正常的組織作為對照，分別稱取30 g癌組織和癌旁組織，加入RIPA蛋白裂解液后用組織研磨機磨碎，按照Western印跡操作方法包括蛋白抽提，電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育，顯影和凝膠圖像分析等步驟，檢測相關蛋白的表達水平。

2　結(jié)　果

2.1健康對照組和結(jié)腸癌Ⅲ期患者血清中g(shù)alectin-3水平比較健康對照組galectin-3的含量〔(1.05±1.24)ng/L〕遠遠低于結(jié)腸癌Ⅲ期患者〔(5.75±1.89)ng/L,P<0.05〕。

2.2實時定量PCR檢測結(jié)腸癌組織中相關基因的表達在結(jié)腸癌組織中AXIN mRNA的表達水平(0.37±0.16)明顯降低(在正常組織中表達設為1，P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)雖然β-catenin mRNA水平在結(jié)腸癌(0.83±0.15)和結(jié)腸癌旁組織(設為1)中沒有差異，但是β-catenin下游分子c-myc和cyclin D1基因mRNA水平在結(jié)腸癌中的表達水平(3.92±0.52、5.19±1.24)較癌旁組織(設為1)高(P<0.01)。

2.3Western印跡檢測結(jié)腸癌組織中Wnt信號通路激活情況結(jié)腸癌組織中β-catenin蛋白的表達條帶灰度較癌旁組織組織(設為1)明顯升高。結(jié)腸癌組織中AXIN蛋白的表達量(3.83±0.87)較癌旁組織明顯降低(P<0.01)；β-catenin蛋白的表達量(3.83±0.87)較癌旁組織(設為1)明顯升高約3.83倍(P<0.01)。見圖1。

圖1　結(jié)腸癌組織中AXIN、β-catenin蛋白的表達水平

2.4Western印跡檢測結(jié)腸癌組織增殖的分子機制結(jié)腸癌組織中c-myc蛋白和cyclin D1蛋白的表達條帶輝度較癌旁組織組織明顯升高，這表明Wnt信號通路可能通過c-myc蛋白和cyclin D1蛋白介導對結(jié)腸癌細胞增殖的促進作用。結(jié)腸癌組織中cyclin D1、c-myc蛋白的表達量(5.06±0.84，4.81±1.05)較癌旁組織(設為1)明顯升高(P<0.01)。見圖2。

圖2　結(jié)腸癌組織中c-myc、cyclinD1蛋白的表達水平

3　討　論

Wnt/β-catenin信號通路由許多分泌糖蛋白構(gòu)成，對于調(diào)節(jié)細胞的歸宿如增殖、分化、極化以及遷移具有重要作用〔8〕。干擾Wnt配體的表達或者改變Wnt/β-catenin信號通路下游分子的表達水平均可以導致小鼠胚胎發(fā)育的異常〔9〕。此外成年人中Wnt/β-catenin信號通路信號通路的異常通常伴隨著癌癥發(fā)生，如乳腺癌，胃癌以及肝癌中〔10〕。目前對結(jié)腸癌的發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中通常伴有Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，但是對于β-catenin在結(jié)腸癌中的具體的作用目前尚不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中Wnt/β-catenin信號通路激活后β-catenin 的轉(zhuǎn)錄水平不變，但是其泛素化降解減少，同時其抑制因子AXIN表達降低，共同促進β-catenin 蛋白水平增加，β-catenin 之后轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)結(jié)合TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)c-myc和cyclinD1基因的表達促進細胞增殖。此外，研究還發(fā)現(xiàn)galectin-3作為一個多功能分泌蛋白，升高的galectin-3促進β-catenin核內(nèi)轉(zhuǎn)運，正向調(diào)控細胞內(nèi)的Wnt信號通路，促進結(jié)腸癌細胞的增殖，抑制結(jié)腸癌細胞的凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路作為結(jié)腸癌增殖、侵襲的關鍵通路，在藥物研發(fā)中可將Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子作為靶位點，對強化結(jié)腸癌的靶向治療具有重大意義。

1Chen KH，Lin YL，Liau JY，etal.BRAF mutation may have different prognostic implications in early-and late-stage colorectal cancer〔J〕.Med Oncol，2016；33(5)：39.

2Xing Y，Clements WK，Kimelman D，etal.Crystal structure of a beta-catenin/axin complex suggests a mechanism for the beta-catenin destruction complex〔J〕.Genes Dev，2003；17(22)：2753-64.

3Wang X，Jung YS，Jun S，etal.PAF-Wnt signaling-induced cell plasticity is required for maintenance of breast cancer cell stemness〔J〕.Nat Commun，2016；7(2)：10633.

4Arsenijevic A，Milovanovic M，Milovanovic J，etal.Deletion of galectin-3 enhances xenobiotic induced murine primary biliary cholangitis by facilitating apoptosis of BECs and release of autoantigens〔J〕.Sci Rep，2016；6(3)：23348.

5Prins CA，Almeida FM，Martinez AM.Absence of galectin-3 attenuates neuroinflammation improving functional recovery after spinal cord injury〔J〕.Neural Regen Res，2016；11(1)：92-3.

6Tripathi M，Dixit A，Chandra PS.Galectin-3，an important yet unexplored molecule in drug resistant epilepsy〔J〕.Neurol India，2016；64(2)：237-8.

7Kim HS，Kim J，Nam KH，etal.Clinical significance of midkine expression in sporadic desmoid tumors〔J〕.Oncol Lett，2016；11(3)：1677-84.

8Alghamdi S，Khan I，Beeravolu N，etal.BET protein inhibitor JQ1 inhibits growth and modulates WNT signaling in mesenchymal stem cells〔J〕.Stem Cell Res Ther，2016；7(1)：22.

9Li T，Lai Q，Wang S，etal.MicroRNA-224 sustains Wnt/beta-catenin signaling and promotes aggressive phenotype of colorectal cancer〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2016；35(1)：21.

10Vilchez V，Turcios L，Marti F，etal.Targeting Wnt/beta-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment〔J〕.World J Gastroenterol，2016；22(2)：823-32.

〔2016-01-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.010

河南省科技攻關計劃項目(No.132102310156)；鄭州市科研項目(No.121PPTGG504-7)

鄒慧娟(1968-)，女，主治醫(yī)師，主要從事感染危重疾病研究。

R735.3+5

A

1005-9202(2016)14-3373-02；

1新鄉(xiāng)市第三附屬醫(yī)院泌尿外科2鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科3鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科