車前草總黃酮對大鼠前列腺增生的治療作用及機制

王琳琳　白　莉

(河南中醫學院藥學院，河南　鄭州　450046)

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車前草總黃酮對大鼠前列腺增生的治療作用及機制

王琳琳白莉

(河南中醫學院藥學院，河南鄭州450046)

目的探討車前草總黃酮對大鼠前列腺增生(BPH)的治療作用及機制。方法清潔級雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、法舒地爾組、車前草總黃酮低、中、高劑量組(n=8)。除對照組外，其余各組大鼠皮下注射丙酸睪酮(7.5 mg/kg，1次/d，連續10 d)復制BPH模型，車前草總黃酮組分別給予車前草總黃酮灌胃治療(分別給予1 mg/kg、10 mg/kg和50 mg/kg灌胃，1次/d，持續60 d)，法舒地爾組給予法舒地爾(5 mg/kg，1次/d，持續60 d)灌胃治療。分析各組大鼠前列腺濕重、前列腺指數、RhoA/ROCK通路蛋白及細胞凋亡蛋白的表達。結果研究發現前列腺增生大鼠前列腺濕重及前列腺指數水平明顯升高，促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白水平明顯升高而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低，RhoA-ROCK1/2和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達明顯升高而轉化生長因子(TGF)-β表達明顯降低(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述指標的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。結論車前草總黃酮能夠通過抑制RhoA/ROCK通路蛋白和細胞凋亡過程發揮改善丙酸睪酮引起的大鼠BPH病理過程。

前列腺增生；車前草總黃酮；法舒地爾；RhoA/ROCK信號通路；細胞凋亡

前列腺增生(BPH)主要表現為尿頻、尿急、尿失禁和夜尿增多等，但發病與吸煙、酗酒、年齡增長等相關，但是其確切的發病機制尚不明確〔1〕。RhoA/Rho激酶(ROCK)信號轉導通路是細胞內普遍存在的信號轉導通路，且與多種生殖系統疾病的發生及發展密切相關〔2〕。本研究旨在分析BPH的發病機制及車前草總黃酮的干預作用。

1　材料與方法

1.1儀器垂直電泳儀購自ABI公司(MINI-PROTEAN TETRA CELL)；半干轉膜儀購自北京六一儀器廠(TE70XP)；全波長酶標儀購自賽默飛世爾(Multiskan Spectrum型)；全自動生化分析儀購自羅氏公司(MODULE P800)；組織勻漿儀購自Roche Applied Science(MagNA Lyser)。

1.2藥品與試劑丙酸睪酮注射液(1 ml：25 mg)購自科倫藥業(國藥準字H40123555)；總蛋白提取試劑盒(Lot20141017)及蛋白定量試劑盒(Lot20141124)購自南京建成生物工程研究中心；半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白檢測試劑盒購自Omega公司；Caspase-9蛋白檢測試劑盒購自R&D公司；Bax和Bcl-2蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白檢測試劑盒購自Elab Science公司；RhoA蛋白檢測試劑盒購自美國BIOO公司；ROCK1/2蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司。所有操作過程均按照說明書進行。

1.3動物清潔級雄性SD大鼠48只，購自上海斯萊克實驗動物中心，許可證號SCXK(滬)20080033，大鼠體重210～230 g，均在恒溫(23℃±2℃)恒濕(55%±5%)條件下適應性飼養7 d，期間自由飲食。

1.4模型復制除對照組外，其余各組大鼠給予一次性皮下注射丙酸睪酮(3 mg·kg-1·d-1)，對照組進行皮下注射等劑量的精制麻油。7 d后車前草總黃酮組和法舒地爾組分別給予車前草總黃酮(低劑量組：1 mg/kg；中劑量組5 mg/kg；高劑量組：10 mg/kg)和法舒地爾(5 mg/kg)灌胃治療，對照組和模型組給予等劑量的溶劑(CMC-Na)灌胃。連續灌胃30 d后頸動脈放血處死動物。

1.5觀察指標本研究分析BPH大鼠前列腺指數變化，前列腺組織中細胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspse-9及Bax/Bcl-2表達；檢測RhoA/ROCK通路蛋白RhoA及ROCK1和ROCK2蛋白表達；分析組織中TNF-α及轉化生長因子(TGF)-β蛋白變化。

1.6免疫印跡法組織于冰水浴中勻漿后進行蛋白定量。以等量總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，待溴酚藍移至凝膠下端后停止電泳。半干法轉膜2 h，然后將纖維素膜用5.0%脫脂牛奶封閉1 h。無菌磷酸緩沖液沖洗3次(10 min/次)后與一抗4℃條件下雜交孵育4 h；無菌磷酸緩沖液沖洗3次(10 min/次)，然后與二抗雜交孵育4 h，無菌磷酸緩沖液沖洗3次(10 min/次)。然后進行顯色、定影，并計算光密度。以β-actin作為內參進行蛋白分子的相對表達計算。

1.7前列腺濕重及指數分析大鼠灌胃治療24 h后稱取大鼠體重，頸動脈放血處死后分離大鼠前列腺，并沉重，計算前列腺指數。前列腺指數=前列腺濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.8統計學方法采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析。

2　結　果

2.1前列腺濕重及前列腺指數變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺濕重及前列腺指數水平明顯高于對照組(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述指標的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見表1。

2.2細胞凋亡蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白水平明顯高于對照組而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達明顯降低(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述指標的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見表2。

表1　前列腺濕重及前列腺指數變化及車前草總黃酮的改善作用±s,n=8)

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與車前草總黃酮高劑量組比較：3)P<0.01；下表同

表2　細胞凋亡蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用分析±s,n=8)

2.3RhoA蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織RhoA蛋白水平明顯高于對照組(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述RohA蛋白表達的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見圖1。

2.4ROCK1、ROCK2蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織ROCK1和ROCK2蛋白水平明顯高于對照組(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述ROCK1及ROCK2蛋白表達的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)，見圖2。

2.5TGF-β及TNF-α蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織TNF-α蛋白水平明顯高于對照組而TGF-β蛋白水平明顯降低(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述蛋白表達的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見圖3。

圖1　RhoA蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用

圖2　ROCK1、ROCK2蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用

圖3　TGF-β及TNF-α蛋白表達變化及車前草總黃酮的改善作用

3　討　論

BPH已成為影響老年人健康和生活治療的主要疾病之一，但是其確切的發病機制尚不明確。本研究表明車前草總黃酮能夠通過抑制RhoA/ROCK通路蛋白和細胞凋亡過程發揮改善丙酸睪酮引起的大鼠BPH病理過程。

RhoA/ROCK通路異常參與了多種病理過程的發生及發展過程，且可能是藥物干預治療的潛在靶點〔3〕。在研究辛伐他汀通過Rho/Rho激酶信號通路抑制高血壓模型大鼠的心血管重構的研究中發現異常的RhoA蛋白信號通路與大鼠心血管重構密切相關，而辛伐他汀能夠通過抑制該通路改善高血壓大鼠的血管重構過程〔4〕。在研究miR-146a通過抑制ROCK1基因的表達促進去勢抵抗性前列腺癌細胞凋亡時發現前列腺癌細胞凋亡過程與ROCK1蛋白的表達變化密切相關，且ROCK2 siRNA能夠對自發性高血壓大鼠勃起功能產生明顯的影響〔5〕。本研究表明ROCK信號通路參與了大鼠前列腺的增生過程，且可以作為藥物治療的靶點。細胞凋亡是由細胞凋亡蛋白參與、維持機體內環境穩定的重要過程。以往的研究證實益腎通膠囊治療后BPH患者前列腺組織中促凋亡蛋白明顯升高而抑凋亡蛋白的表達明顯降低，即細胞凋亡過程參與了BPH患者前列腺異常過程〔6〕。以往的研究也發現A1蛋白與前列腺特異性抗原對前列腺癌與BPH臨床診斷具有重要的參考價值〔7〕。方志啟等〔8〕也發現凋亡相關基因p53、Bcl-2、Bax的表達與BPH的發生、發展及患者預后密切相關。本研究也表明細胞凋亡過程也參與了大鼠BPH過程，且可作為車前草總黃酮的作用靶點。

炎癥反應參與了細胞內幾乎所有的病理過程，且與前列腺的多種病理過程密切相關。在研究水飛薊賓磷脂復合物對大鼠自身免疫性前列腺炎炎性細胞因子影響的研究中發現大鼠自身免疫性前列腺炎的發生與機體內炎癥反應因子水平異常相關，且藥物可通過改善炎癥反應發揮治療作用〔9〕。以往的研究也發現當歸貝母苦參煎劑能通過調節TNF-α的異常表達對實驗性慢性細菌性前列腺炎發揮治療作用〔10〕，且白細胞介素(IL)-10和TNF-α在BPH及前列腺癌的臨床診斷中具有重要的參考價值〔11〕。王磊等〔12〕也證實合并組織學炎癥的BPH組織中IL-6、TNF-α表達存在明顯的異常，且可作為臨床診斷的重要標志物。本研究表明TNF-α、TGF-β也與大鼠BPH過程密切相關。因此，車前草總黃酮能夠通過抑制RhoA/ROCK通路蛋白和細胞凋亡過程發揮改善丙酸睪酮引起的大鼠BPH病理過程。

1葉挺宇,盧湧湧,潘悅,等.血府逐瘀湯加減聯合西藥治療老年性前列腺增生的臨床療效〔J〕.中華中醫藥學刊,2014;32(12):2939-41.

2賀哲淳,楊晶,賀菊喬,等.前癃通膠囊對良性前列腺增生癥前列腺體積影響的臨床觀察〔J〕.湖南中醫藥大學學報,2014;34(11):40-2.

3陳曦,史運迪,鐵璐.Rho激酶(ROCK)在糖尿病并發癥中的研究〔J〕.生理科學進展,2015;46(6):433-8.

4朱宏明,賈玲.辛伐他汀通過Rho/Rho激酶信號通路抑制高血壓模型大鼠的心血管重構研究〔J〕.中國藥房,2013;24(5):415-8.

5朱秀波.ROCK2 siRNA對自發性高血壓大鼠勃起功能的影響〔D〕.瀘州：瀘州醫學院,2014.

6潘恩山,李煜罡.益腎通膠囊治療后BPH患者前列腺組織中促凋亡蛋白、抑凋亡蛋白的表達變化〔J〕.山東醫藥,2014；54(47):71-3.

7馬增煌.A1蛋白與前列腺特異性抗原在前列腺癌與前列腺增生疾病中聯合檢測的意義〔J〕.實用老年醫學,2014;28(1):49-51.

8方志啟,吳剛,王賀彬,等.凋亡相關基因p53、bcl-2、bax在前列腺組織中的相關性〔J〕.中國臨床解剖學雜志,2013;31(5):560-3.

9陳華,陳鈞,楊學娟,等.水飛薊賓磷脂復合物對大鼠自身免疫性前列腺炎炎性細胞因子的影響〔J〕.中國藥房,2013;24(41):3873-5.

10何麗清,傅延齡,馬艷紅,等.當歸貝母苦參煎劑對實驗性慢性細菌性前列腺炎大鼠前列腺TNF-α的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2012;18(2):212-4.

11孫國華,寧方霞,夏玉軍.IL-10、TNF-α在前列腺增生及前列腺癌組織中的表達及意義〔J〕.泌尿外科雜志(電子版),2012;4(1):25-8.

12王磊,劉致中,楊磊,等.合并組織學炎癥的前列腺增生組織中IL-6、TNF-α表達的研究〔J〕.臨床泌尿外科雜志,2014;29(9):787-90.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.005

河南省高校重點科研項目(No.16A350017)

王琳琳(1983-)，女，碩士，講師，主要從事中藥及活性成分藥效學研究。

R285

A

1005-9202(2016)14-3359-04；