土黨參多糖對半乳糖聯合三氯化鋁致阿爾茨海默病小鼠腦損傷的影響

1　材料與方法

1.1動物SPF級KM小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2007-001。

1.2藥材與試劑CJP由本課題組提供，多糖含量≥95%；考馬斯亮藍、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、乙酰膽堿(Ach)等試劑盒購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.3主要儀器小鼠跳臺記錄儀(參照課題組專利自制)；Morris水迷宮改良自制(仿中國醫學科學院藥物研究所)；RM2235切片機(德國Leica 公司)；MD Spectra Max-190連續波長酶標儀(美國MD公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組及給藥KM小鼠120只，自由進食和飲水，適應性飼養7 d后隨機分為空白組(Blank)、模型組(Model)、CJP高劑量(300 mg/kg，CJP-H)、中劑量(150 mg/kg，CJP-M)、低劑量組(75 mg/kg，CJP-L)，腦復康對照組(150 mg/kg，NFK)。藥物用0.5%的CMC-Na配制，按小鼠體重0.2 ml/10 g于造模前3 d開始灌胃，空白組接受皮下注射相應的無菌生理鹽水及灌胃生理鹽水；CJP不同劑量組及陽性對照組灌胃給藥3 d后，模型組及給藥組早上皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)，間隔2 h后灌服生理鹽水或者CJP，下午灌服三氯化鋁(20 mg/kg)造成AD小鼠模型，連續造模10 w。

1.4.2行為學檢查

1.4.2.1跳臺法實驗裝置是10 cm×10 cm×50 cm小鼠跳臺反應箱，分為5間，箱底是可通36 V電壓連續刺激的銅柵。右后角置一直徑和高均為4.5 cm的橡皮墊，作為小鼠回避電擊的安全區。外置高清晰攝像頭監控小鼠活動情況，記錄實驗結果。實驗時先將小鼠置于跳臺儀中，適應環境3 min，然后底部銅柵通以36 V、2 mA交流電，記錄動物受到電刺激后跳上橡皮墊的反應時間和5 min內受到電擊的次數(錯誤次數)作為學習成績。24 h后將小鼠置于跳臺儀中適應3 min，再將其置于橡皮墊上，記錄第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min受電擊的次數(錯誤次數)作為學習成績。

1.4.2.2暗箱法試驗時，先將小鼠背朝洞口放入明室，同時開始計時和通電(36 V，2 mA交流電)，小鼠進入暗室立即遭到電擊，記錄小鼠受到電擊的時間，以此作為學習成績。24 h后記錄小鼠第一次進入暗室的時間和5 min內的錯誤次數以此作為記憶成績。

1.4.2.3Morris型水迷宮〔4〕實驗前1～5 d讓小鼠在Morris水迷宮中定向游泳。將安全臺固定在標有東、南、西、北的任意一個位置不動，每天下午訓練，每次隨機取均分安全臺對面半圓的5個點放入小鼠，記錄小鼠入水時間和自入水到小鼠自行找到并爬上安全臺所需時間作為潛伏期。爬上安全臺后，讓其在安全臺上停留5 s。若小鼠120 s后還未找到安全臺，則人為將小鼠引導上安全臺停留5 s后，將小鼠從安全臺上撤離下去休息，連續訓練5 d。第6～7天進行空間探索實驗，在定向游泳實驗結束后，立即將安全臺拆離，仍隨機取5個入水點中的一個放入小鼠，計時小鼠在原安全臺所在象限中停留的時間和經過原象限的次數，計算2 d平均值作為成績。

1.4.3小鼠腦組織中指標檢測小鼠Morris水迷宮實驗結束后，立即處死小鼠并迅速取腦組織，稱重，加入0.9%的冰冷生理鹽水，制備成10%的腦勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液測定其中的SOD、MDA、NO、GSH、Ach等生化指標。

1.5統計學處理采用SPSS17.0軟件行方差分析和t檢驗。

2　結　果

2.1CJP對AD腦損傷小鼠學習記憶障礙的影響與Model組〔(147.11±68.66)s〕比較，藥物組〔CJP-L、CJP-M、CJP-H組分別為(237±105.95)s、(253±103.25)s、(255.65±93.47)s〕記憶潛伏期顯著延長(P<0.01)。藥物組在實驗劑量范圍內能較好改善小鼠的學習記憶障礙，與NFK組〔(248.02±116.31)s〕比較無統計學差異(P>0.05)。Blank組記憶潛伏期為(251.77±122.49)s。小鼠在經過連續5 d的Morris水迷宮訓練后，游泳時間(學習記憶潛伏期)呈現出遞減規律。Model組小鼠潛伏期變化不大，其他組的潛伏期顯著縮短。見圖1。在第3天，Model組定向航行時間顯著高于Blank組、藥物組、NFK組，說明藥物可提高學習記憶能力。第6、7天撤去平，結果Blank組、藥物組和NFK組小鼠經過原象限的時間和次數與Model組相比具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。見表1。

圖1　各組小鼠Morris水迷宮定向航行的逃避潛伏期

組別劑量(mg/kg)時間(s)次數Blank組042.73±7.893.22±0.973)Model組026.99±7.111)1.40±0.371)CJP-L組7537.17±10.052)3.30±1.103)CJP-M組15038.18±4.802)3.58±1.673)CJP-H組30039.37±7.032)3.82±1.393)NFK10041.30±17.013)3.60±2.113)

與Blank組比較：1)P<0.01；與Model組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2CJP對AD小鼠腦組織中相關指標的影響與Blank組比較，Model組小鼠大腦組織中MDA、NO增高，而GSH、SOD含量降低，但除了SOD含量差異有統計學意義(P<0.05)以外，其他指標差異不顯著。與Model組相比，CJP 3個劑量組MDA、NO含量降低，GSH、SOD含量增加，其中CJP-M、-H組MDA和SOD含量差異有統計學意義(P<0.05)。造模70 d后，CJP-H組小鼠腦組織Ach含量接近正常值，CJP-L組尚未回升至正常水平(P<0.05)。見表2。

表2　CJP對小鼠大腦組織生化指標的影響

與Blank組比較：1)P<0.05；與Model組比較：2)P<0.05

3　討　論

有學者報道D-半乳糖和三氯化鋁制作的多重復制AD小鼠模型能導致小鼠記憶減退、皮質和海馬產生老年斑等AD樣癥狀〔5〕，成本低廉。AD一般發生在老年人群中，年齡增長是發病的一大危險因素，可通過對成年小鼠注射半乳糖，造成亞急性衰老模型模擬AD發病特點〔6〕。三氯化鋁超過正常攝入量可導致動物行為異常，如食欲下降、反應遲鈍、行動遲緩、學習記憶能力下降；同時，破壞膽堿能神經功能，還可增強β-分泌酶和γ-分泌酶活性，增加淀粉樣蛋白的產量。鋁攝入過量而積聚可使反應性星形膠質細胞被激活引發炎性級聯反應，促使其以不溶性形式沉積于腦組織，形成老年斑〔7,8〕。

關于AD 的發病機制，目前比較認可的假說為氧化應激假說、自由基損傷假說、能量代謝假說、淀粉樣蛋白級聯反應假說以及膽堿能假說等〔9〕。AD患者體內SOD 和MDA 水平變化情況，可作為臨床上診斷AD的主要方法〔10〕。Ach是腦內重要的神經遞質，膽堿能系統對機體維持正常的認知功能發揮重要作用。Ach在皮質和海馬的缺失將導致學習記憶認知功能顯著降低〔11〕。研究發現，增加認知障礙患者海馬Ach 濃度后，認知和空間記憶功能均得到改善〔12〕。本研究顯示，CJP對SOD、MDA、Ach的影響比較明顯。

1楊小生,張占軍,楊再昌,等.土黨參多糖、衍生物及其制備方法和應用:中國200510200024.2〔P〕.2007-09-12

2張振東,楊娟,吳蘭芳,等.土黨參多糖對小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國藥理學通報,2011;27(4):508-11.

3Scali C,Prosperi C,Vannucchi MG,etal.Brain inflammatory reaction in an animal model of neuronal degeneration and its modulation by an anti-inflammatory drug:Implication in Alzheimer's disease〔J〕.Eur J Neurosci,2000;12(6):1900-12.

4黃忠仕,焦楊,張士軍,等.龍眼參多糖對老年癡呆模型SAMP8小鼠學習記憶的改善作用〔J〕.中國老年學雜志,2008;28(21):2086-8.

5羅煥敏,肖飛.D-半乳糖和三氯化鋁誘導小鼠產生類阿爾茨海默病變〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，2004;18(1):22-6.

6Wang W,Li S,Dong HP,etal.Differential impairment of spatial and nonspatial cognition in a mouse model of brain aging〔J〕.Life Sci,2009;85(3-4):127-35.

7Rao KSJ，Anitha S，Latha KS.Aluminium-induced neurodegeneration in the hippocampus of aged rabbits mimics Alzheimer's disease〔J〕.Alzheimer Rep，2000;3(2):83-8.

8趙憲林,季東培,方秀斌,等.血管性癡呆大鼠海馬神經元超微結構的研究〔J〕.解剖科學進展,2000;6(2):161-3.

9Christian B.Alzheimer's disease and oxidative stress:implication for novel therapeutic approaches〔J〕.Prog Neurobiol,1999;57(3):301-23.

10Cahill JF,Baxter MG.Cholinergic and noncholinergic septal neurons modulate strategy election in spatial learning〔J〕.Eur J Neurosci,2011;14:1856-64.

11Gron G,Brandenburg I,Wunderlich AP,etal.Inhibition of hippocampal function in mild cognitive impairment:targeting the cholinergic hypothesis〔J〕.Neurobiol Aging,2009;27:37-45.

12Steiner JP,Hamilton GS,Ross DT,etal.Neurotrophic immunophilin ligands stimulate structural and functional recovery in neurodegenerative animal models〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(5):2019-24.

〔2015-11-20修回〕

(編輯郭菁)

The effect of Campanumoea javanica polysaccharide on brain injury of Alzheimer's mice induced by D-galactose and aluminium chloride

ZHANG Zheng-Dong,PENG Mei,YANG Juan.

Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,Guizhou,China

ObjectiveTo study the effect of Campanumoea javanica polysaccharide(CJP)on brain injury of Alzheimer's mice induced by D-galactose and aluminium chloride.MethodsThe nervous system of mice were damaged by subcutaneous injection of D-galactose and intragastric administration of AlCl3.The effects of CJP on brain damage in mice were studied,including the observation of learning and memory performance,the contents of malondialdehyde(MDA),nitric oxide(NO),glutathione(GSH)and acetylcholine(Ach).ResultsCompared with model group,CJP improved the learning and memory abilities,increase the contents of GSH and SOD in brain,while decrease the contents of NO and MDA.ConclusionsCJP has certain effect on brain injury induced by D-galactose combined with aluminum chloride.

Campanumoea javanica polysaccharide;D-galactose;Aluminium chloride;Brain injury

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.002

國家自然科學基金資助課題(No.81160513)

楊娟(1971-)，女，研究員，博士，碩士生導師，主要從事天然藥物研究。

張振東(1982-)，男，中級工程師，碩士，主要從事食品質量與安全研究。

R741

1005-9202(2016)14-3353-03；

1阜陽市食品藥品監督管理局

土黨參多糖對半乳糖聯合三氯化鋁致阿爾茨海默病小鼠腦損傷的影響

1 材料與方法

2 結 果

3 討 論

1　材料與方法

2　結　果

3　討　論