秦嶺細鱗鮭物種有效性的探討

杜巖巖，王　太，楊順文，史小寧（甘肅省水產研究所/甘肅省冷水性魚類種質資源與遺傳育種重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

秦嶺細鱗鮭物種有效性的探討

杜巖巖，王太，楊順文，史小寧
（甘肅省水產研究所/甘肅省冷水性魚類種質資源與遺傳育種重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

采用PCR技術獲得細鱗鮭秦嶺亞種25尾個體的線粒體DNA控制區598bp的序列，從GeneBank下載黑龍江流域的尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭的同源序列，以近緣物種哲羅鮭為外類群，構建了中國細鱗鮭屬的分子系統發育樹，并結合形態特征討論了細鱗鮭秦嶺亞種的有效性。遺傳結構分析顯示，秦嶺亞種與黑龍江流域兩種細鱗鮭之間以及后兩種細鱗鮭之間的遺傳距離分別為：0.0202，0.0207，0.0199，明顯大于細鱗鮭屬種內遺傳距離：0.0023，0.0033，0.0091。以鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）構建的系統發育樹表明，秦嶺地區的細鱗鮭單獨構成一個單系群，而黑龍江流域的兩種細鱗鮭構成一個大的支系。以上結論證明了秦嶺細鱗鮭已經達到了亞種水平的分化，該研究的結果支持形態分類上秦嶺亞種的分類地位。

線粒體DNA控制區基因；分類地位；秦嶺細鱗鮭

細鱗鮭（Brachymystaxlenok）隸屬于鮭形目鮭科鮭亞科。在我國主要分布在東北地區黑龍江流域、綏芬河、圖們江、鴨綠江；新疆的額爾齊斯河；河北省北部白河及灤河上游以及秦嶺北麓渭河流域［1，2］。黃洪富等（1964）在渭河上游首次發現細鱗鮭的分布［3］，超出了張春霖（1957）和T.B.尼科里斯基（1960）等認為細鱗鮭只分布在蘇聯西伯利亞、中國東北以及朝鮮鴨綠江流域的范圍。李思忠（1966）根據幽門盲囊、側線鱗和最小性成熟年齡等形態學和生理學特征，把分布在秦嶺地區的細鱗鮭定名為細鱗鮭的一個新亞種-秦嶺亞種Brachymystaxlenok tsinlingensis Li，同時指出分布在黑龍江和新疆等地的細鱗鮭為指名亞種Brachymystax lenok（Pallas），并沿用多年。隨后李國良（1986）將分布于河北北部的細鱗鮭也歸屬于秦嶺亞種［4］。到了20世紀80年代，一些學者基于形態學（宋世良等，1984；王鴻媛，1988；秦樹臻等，1989）對分布于黑龍江流域與分布于秦嶺地區的細鱗鮭進行研究，指出分布于河北、甘肅與東北地區的細鱗鮭的側線鱗、鰓耙數以及幽門垂數等主要性狀上的差異并不明顯，并用生化（秦樹臻等，1989）的方法對河北、東北及甘肅采的細鱗鮭進行肌肉、腦及肝組織中的LDH進行同工酶譜分析，結果也顯示并無明顯差異，于是指出在我國分布的細鱗鮭只有一種，并無秦嶺亞種的分化［5-7］。馬波等（2005；2009）基于形態學與線粒體DNA控制區序列分析了黑龍江流域的細鱗鮭，并認為在黑龍江流域有兩種，即鈍吻細鱗鮭Blunt-snouted lenok與尖吻細鱗鮭Sharp-snouted lenok，但對于古黃河及秦嶺等地區的細鱗鮭屬于亞種分化還是屬于地理種群分化沒有進行分析［8-9］。夏穎哲等（2006）研究顯示，分布于我國東部地區不同水系的細鱗鮭種群間產生顯著的遺傳分化，但未對是否存在秦嶺亞種分化進行探討［10］。

線粒體DNA（mtDNA）由于結構簡單、進化速度快、幾乎不發生重組、嚴格的母系遺傳等特點，使得mtDNA成為探討物種起源、系統發生和種內遺傳分化的有效遺傳標記［11］。mtDNA控制區（D-loop）為非編碼區，選擇壓力小，所以比其他線粒體基因的進化速率更快［12］，因此，mtDNA控制區序列已經廣泛應用于研究近緣物種、較遠緣物種和快速形成的物種間系統進化關系與一些物種的有效性［13-15］。本研究測定了秦嶺地區細鱗鮭的線粒體控制區的部分基因序列，結合GenBank中已知細鱗鮭屬魚類的基因序列進行分子系統關系研究，旨在為細鱗鮭秦嶺亞種的分類學地位提供分子生物學依據。

1　材料與方法

1.1樣品采集和DNA提取

細鱗鮭秦嶺亞種主要分布于秦嶺地區的渭河流域較大支流中。野外采集到25份尾鰭樣品（表1），1尾采自甘肅華亭縣境內的麻庵河（25號樣品），2尾采自武山縣境內的西河（23，24號樣品），22尾采自張家川回族自治縣內的馬鹿河（1～22號樣品），用無水乙醇固定帶回實驗室進行分析。主要形態學特征比較見表2。采用酚/氯仿法提取基因組DNA，從Genbank里下載細鱗鮭控制區的同源序列。

表1　樣本的名稱、來源及單倍型

表2　不同地區細鱗鮭主要形態比較

1.2 PCR擴增和序列測定

擴增mtDNA控制區序列的引物：正向引物為：LRBT-25：5′-AGA GCG CCG GTG TTG TAA TC-3′；反向引物為：LRBY-1195：5′-GCT AGC GGG ACT TTC TAGGGT-3′［16］。PCR反應體系為25 μL，其中包括1 UTaqDNA聚合酶（TaKaRa），1 μLdNTPs（2.5 mmol/L），5 μL 10xTaq buffer（TaKaRa，含Mg2+），兩條引物（10 mmol/L）各1 μL，3 μLDNA模板，其余雙蒸水補足。PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個循環；反應結束后在72℃再延伸8 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物工程公司純化并測序，測序引物為擴增引物。

1.3數據分析

測序獲得的序列通過Chromas 1.45軟件獲得原始序列數據，并進行人工校正；利用CLUSTAL X2軟件對所有序列進行比對。用DnaSP 5.0軟件計算單倍型數、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等；運用Arlequin 3.1軟件計算各種間的遺傳分化指數FST值；用Mega 4.0軟件統計堿基組成，用Kimura2-papamter模型計算單倍型及群體間的遺傳距離，并以細鱗鮭的近緣物種哲羅鮭Hucho taimen（AY862359）為外類群，用鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）構建細鱗鮭屬分子系統樹，系統樹中節點的自舉置信水平應用自引導估計，循環次數為1 000次。

2　結果

2.1形態學比較

結合文獻資料，由表2可以看出，李思忠以幽門盲囊、鰓耙數、側線鱗和體長等可數可量性狀將分布在秦嶺地區的細鱗鮭作為新亞種的做法有欠缺依據不足，通過比較可以明顯看出，五個地區的細鱗鮭在幽門盲囊、鰓耙數和側線鱗等可數性狀上呈連續分布，且相互之間重疊率較高，其中秦嶺地區細鱗鮭的幽門盲囊（69-88）與灤河地區細鱗鮭幽門盲囊（66～93）完全重疊，側線鱗數目（113～124）與額爾齊斯河流域細鱗鮭側線鱗數目（113～129）完全重疊。在可量性狀的比較中，僅以體長的數值作為分類依據是不可靠的，在魚類中體長與年齡呈一種動態變化。表2中，秦嶺渭河流域細鱗鮭的頭長/眼徑（4.09～4.53）、頭長 /吻長（3.75～4.57）兩個特征與額爾齊斯河流域細鱗鮭頭長/眼徑（4.0～5.3）、頭長/吻長（3.6～4.6）范圍值完全重疊。但秦嶺地區細鱗鮭的體長/體高（3.48～3.73）與其他地區細鱗鮭的體長/體高（3.6～4.88）重疊比較低。

2.2序列變異特征

本研究中，所測的25個個體均獲得線粒體控制區序列598bp，檢測出3個單倍型，單倍型多樣性為0.227，核苷酸多樣性為0.00064。其中采集于武山縣西河的2個個體檢測出一個單倍型（WS），采集于張家川馬鹿河的22個個體檢測出 2個單倍型（ZJC和ZJCHT），采集于華亭縣麻庵河的一個個體與張家川馬鹿河其中一個單倍型共享（ZJCHT）。將從GenBank中下載的黑龍江地區水系的尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭共9個單倍型作為整體分析時，共檢測出12個單倍型，本次所測的樣品與其不存在單倍型共享。在598個位點中，存在29個變異位點（4.85%），其中包括19個簡約信息位點（parsim-info sites）和10個單突變位點（singleton sites）。堿基組成分析顯示，A、T、C和G堿基平均含量分別為31.9%、30.5%、22.9%和14.7%，其中A+T含量（62.4%）明顯高于G+C含量（37.6%），表現出明顯的反G偏倚。所有序列間沒有出現缺失與插入，轉換數4個，顛換數1個，平均轉換與顛換數比值為4.3。用于分析的序列單倍型提交GeneBank中，登錄號為KC136268～KC136270。

2.3序列遺傳分析

以Mega 4.0軟件基于Kimura 2-parameter模型的遺傳距離計算見表3。由表3可以看出，鈍吻細鱗鮭單倍型之間的遺傳距離在0.0017～0.0034之間，最大值出現在單倍型BSW1與BSW2之間，種內平均遺傳距離為0.0023；尖吻細鱗鮭單倍型之間的遺傳距離在0.0017～0.0118之間，最大值出現在單倍型SHM1與SKL1之間，最小值出現在單倍型SWS1與SWS2之間，種內平均遺傳距離為0.0091；鈍吻細鱗鮭與尖吻細鱗鮭單倍型之間的遺傳距離在0.0153～0.0239之間，種間平均遺傳距離為0.0199。而秦嶺細鱗鮭單倍型間的遺傳距離在0.0008～0.0050之間，種群內平均遺傳距離為0.0033，遺傳分化均較小；而秦嶺細鱗鮭與尖吻細鱗鮭單倍型之間的遺傳距離在0.0153～0.0273之間，平均遺傳距離為0.0207，與鈍吻細鱗鮭單倍型之間的遺傳距離在0.0171～0.0239之間，平均遺傳距離為0.0202。運用Arlequin 3.1軟件計算各種間的遺傳分化指數FST值（對角線以上）分析顯示，細鱗鮭三個種FST P值均小于0.01的檢驗水平，且秦嶺地區的細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭的FST值最大（0.86111），與尖吻細鱗鮭之間以及尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭之間的數值為0.65234和0.65121，可以看出秦嶺地區的細鱗鮭與黑龍江流域的細鱗鮭遺傳分化明顯。

表3　細鱗鮭屬線粒體控制區序列的遺傳分化指數（FST）和Kimura 2-parameter遺傳距離（對角線及以下為遺傳距離，對角線以上為遺傳分化指數）

2.4系統聚類關系

以細鱗鮭近緣屬哲羅鮭 （Hucho taimen，AY862359）為外類群，用Mega 4.0軟件采用鄰接法（NJ）法和最大簡約法（MP）對尖吻細鱗鮭、鈍吻細鱗鮭與甘肅地區的細鱗鮭的同源序列進行分子系統關系分析，兩種方法構建的系統發育樹的拓撲結構完全一致，區別在一些節點的支持率有所不同（圖1）。圖中顯示所有的細鱗鮭個體的單倍型在分子系統樹中構成一個大的分支，并明顯的分成2個顯著地獨立進化分支，其中尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭的單倍型聚為一個進化分支，并有55%說明尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭的親緣關系較秦嶺細鱗鮭更近，而秦嶺細鱗鮭的單倍型則獨自構成一個節點支持率100%和99%進化分支。

3　討論

亞種是某個種的表型上相似種群的集群，棲息在該物種分布范圍內的次級地理區，在分類學上和該種的其他種群不同（Mayret al.，1991），這也可以認為亞種在分子水平上應該也是一個獨立的進化單元［17］。李思忠（1966）在秦嶺太白、周至等地采集了40尾細鱗鮭標本，通過與黑龍江流域細鱗鮭進行形態學比較認為是一個新亞種。這與馬波等（馬波等，2009）所指出分布于秦嶺地區的細鱗鮭與黑龍江流域存在的尖吻和鈍吻細鱗鮭對比的形態特征基本處于尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭的中間類型一致，而且為我國所特有。但綜合文獻報道，初步的形態學特征比較顯示（表2），五個地區的細鱗鮭在可量可數性狀上基本是連續的。但單獨來看分布于秦嶺地區與黑龍江流域的細鱗鮭，則秦嶺地區的細鱗鮭在鰓耙數和頭長/眼徑兩個特征上基本上介于黑龍江流域兩種細鱗鮭之間，幽門盲囊數、體長/體高及體長/頭長等特征明顯低于黑龍江流域兩種細鱗鮭，而頭長/吻長則與鈍吻細鱗鮭接近并明顯大于尖吻細鱗鮭，這些特征的比較結果表明，分布于秦嶺地區的細鱗鮭與黑龍江流域的兩種細鱗鮭在形態上有明顯的區別，這與李思忠把這兩地區的細鱗鮭比較得出的結論一致。但是，秦嶺地區細鱗鮭與灤河、鴨綠江和額爾齊斯河三個地區的可數可量性狀較近，且在部分性狀有完成重疊的現象，但是在體長/體高這一可量性狀上可明顯區別于這三個地區的細鱗鮭。本研究以線粒體DNA控制區部分基因序列對采自秦嶺地區與黑龍江流域的細鱗鮭構建的NJ樹和MP樹進一步顯示，尖吻細鱗鮭與鈍吻細鱗鮭一起構成姐妹群，而采自秦嶺地區的25尾細鱗鮭在系統發育上具有單系性，獨立構成一個獨立的進化分支，且支持率達99%和100%，這與大口黑鱸［18］、虎［19］、林蛙（Rana altaica）［20］等亞種在系統樹中都以單系出現相似。但是也有很多傳統意義上的亞種沒有形成一個獨立的進化單元［21，22］。

圖1通過鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）構建的細鱗鮭屬線粒體控制區序列的系統發育樹

除了在進化樹上形成為單系外，物種內不同地理種群之間的分化程度是否達到亞種的水平還要看各分支之間的遺傳距離是否差異顯著［23］。細鱗鮭秦嶺亞種與尖吻細鱗鮭（平均遺傳距離0.0207）和鈍吻細鱗鮭（平均遺傳距離0.0202）之間的遺傳距離都遠遠大于群體內的平均遺傳距離（0.0033，0.0023，0.0091），且與已報道的基于D-loop區的黑龍江流域兩種細鱗鮭之間的遺傳距離0.0190（馬波等，2009）相近。由此可見分布于秦嶺地區的細鱗鮭與分布于黑龍江流域的細鱗鮭之間的遺傳分化明顯，并且已經達到了亞種的分化水平。因此，本研究的結果從分子角度支持傳統形態分類上的秦嶺細鱗鮭亞種的分類地位。對分布于河北、遼寧及新疆等地區的細鱗鮭是否是秦嶺亞種或其他，需采樣對其進一步驗證。

由于NJ和MP系統發育樹的拓撲結構相同，此處僅顯示NJ系統發育樹，節點上數據從左到右為MP、NJ的BP值（%，僅顯示≥50%的值）。

細鱗鮭屬魚類的現代分布中心是北冰洋流域的西伯利亞地區，經推斷細鱗鮭的起源中心也應該是西伯利亞地區（秦樹臻等，1989）。李思忠（1984）認為，我國的鮭科魚類都是冰川期的殘留魚類。從約距今260萬年前的第四紀開始，我國曾有四次大的冰川進退（李四光，1972）。起源與分布在西伯利亞地區的細鱗鮭，隨著冰期與間冰期的反復，沿日本海向南擴散至黃海和渤海，由于鮭科魚類朔河回游產卵繁殖的需要，沿黃河古道朔河而上，洄游至渭河流域進行產卵繁殖，隨著冰川的消失，大部分種群返回到原發源地，而一部分被滯留在渭河流域的高山溪流里，并被長期封閉在那些地區。若以每百萬年1%序列分歧計算［24］，則秦嶺細鱗鮭與黑龍江流域的細鱗鮭的遺傳分化大約始于200萬年前，即從第四紀初的早更新世冰期就被封閉在秦嶺地區的溪流里。海洋中的魚類由于水域相通，群體間可以產生頻繁的基因交流，遺傳分化一般都比較低，而不同水系的淡水魚類種群間由于受海洋或者山系的隔離，基因分化程度一般都比較高［25］。鑒于秦嶺地區的水系與黑龍江流域的水系完全隔離的格局，秦嶺地區渭河水系的細鱗鮭與黑龍江流域細鱗鮭之間基本上沒有基因交流，完全生殖隔離，分布于這些水系的細鱗鮭不斷的積累具有種群特異性的遺傳變異，可能在形態特征上還沒有表現明顯，但在分子數據方面已經表現出了很大的差異，并已經達到了亞種的分化。

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（編輯：高真貞）

S965.232

A

1006-799X（2016）11-0122-05

項目名稱：國家自然科學基金項目（31460560）。

杜巖巖（1983-），女，山東臨沂人，助理工程師，主要從事魚類種質資源保護研究。