非綜合征型感音神經性聾患兒GJB2基因突變分析*

石之驎王沙燕張阮章

非綜合征型感音神經性聾患兒GJB2基因突變分析*

石之驎①王沙燕②張阮章②

目的：對非綜合征型感音神經性聾患兒的耳聾基因突變進行具體分析，研究GJB2基因突變與相應的特異性臨床表現，為耳聾患者的遺傳咨詢、產前診斷以及臨床治療提供理論基礎。方法：收集深圳地區遺傳性非綜合征耳聾患者100例和健康對照組50例，應用聚合酶鏈反應和直接測序法，檢測GJB2基因的突變情況。結果：通過基因對照，發現100例耳聾患者中共檢出攜帶GJB2 235delC點突變56例，占56%。其中，26例為純合性突變，30例為雜合性突變。結論：GJB2基因突變是非綜合征型感音神經性聾人群重要的分子病因之一，GJB2基因最為常見的突變類型是235delC，對GJB2基因進行臨床檢測具有重大意義。

耳聾； GJB2基因； 基因突變； PCR擴增； 限制性內切酶酶切分析

Mutation Analysis of GJ B2 Gene in Children with Non-syndrome type Neurosensory Deafness

First-author’s address：The Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518112，China

由于家族遺傳和多種生存因素的影響，感音神經性耳聾成為高發率疾病之一，根據產生原因可分為遺傳性耳聾與非遺傳性耳聾。通過研究發現，作為常見的遺傳性疾病之一，遺傳性耳聾主要由多種相應的基因突變導致［1-3］。遺傳性耳聾又細分為綜合征耳聾（syndromic hearing loss， SHI）和非綜合征耳聾（non-syndromic hearing loss，NSHL）［4］，其中，經過多年臨床研究發現，NSHL主要通過常染色體隱性遺傳，占79%，由GJB2（gap junction beta2）基因突變所導致的重度及極重度語前聾占其中的51%［14］。筆者通過對非綜合征型感音神經性聾患兒的耳聾基因突變進行具體分析，研究GJB2基因突變與相應的特異性臨床表現，從而為耳聾患者的遺傳咨詢和產前診斷提供理論基礎，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集深圳地區遺傳性非綜合征耳聾患者100例和健康對照組50例，提取DNA，利用PCR擴增及限制性內切酶酶切分析初篩GJB2 235delC突變者，然后再進行DNA直接測序。

1.2方法

1.2.1DNA制備 使用試劑盒提取DNA，根據試劑盒中的說明書步驟進行DNA提取，利用紫外分光光度計對提取的適量DNA進行定量和純度檢測，余量放-60 ℃冰箱保存備用。

1.2.2引物設計與合成 可以通過上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物。A片段中的正向引物序列為Cx26AF：5’-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC-3’，反向引物序列 為Cx26AR：5’-GCCTTCGATGCGGACCTTC-3’；B片段中的正向引物序列為Cx26BF：5’-CCGGAGACATGAGAAGAAGAG-3’，反向引物序列為Cx26BR：5’-TGAGCACGGGTTGCCTCATC-3’［15］。

1.2.3235delC 酶切檢測 通過PCR反應進行DNA編碼區的擴增。PCR產物20μL加入限制性內切酶ApaI（MBI公司）2.5μL，相應的緩沖液3μL加雙重蒸餾水至總體積30μL。2%瓊脂糖凝膠電泳。正常PCR產物中有ApaI酶切位點GGGCCC，可被酶切為155 bp和267 bp兩條帶；如有235delC突變，酶切位點就會消失；如為純合突變，其PCR產物不被酶切，僅有一條442 bp的條帶；如為雜合突變，則其中一條DNA鏈被酶切為155 bp和267 bp兩條帶，另一條DNA鏈不被消化，即會出現三條帶：422 bp、155 bp和267 bp。

1.2.4DNA測序 對酶切反應的PCR產物進行純化處理，再作Cycle Sequencing反應。反應過程中的實驗條件為95 ℃1 min，95 ℃變性10 s，5 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，循環25次［16］。對反應產物進行醋酸鈉/酒精純化，用ABI377測序儀進行直接測序（正反向測序），通過DNAstar軟件的SeqMan分析測序結果。

2　結果

2.1臨床資料分析 對100例耳聾患者進行純音測聽檢查、聽性腦干反應檢查。聽性腦干反應檢查結果與純音測聽檢查結果相符，見表1。

表1　100例耳聾患者純音測聽結果

2.2酶切結果 對100例感音神經性耳聾患兒和對照組樣本進行酶切反應，觀察并查出GJB2 235delC位點突變。對酶切產物進行電泳處理后發現：100例耳聾患者中三條條帶（853 bp、467 bp和300 bp）者3例，說明存在GJB2 235delC雜合突變；一條條帶（300 bp）者2例，說明GJB2 235delC純合突變，其余為兩條條帶（155 bp和267 bp），說明無235delC 突變，見圖1。

圖1　235delC酶切圖

2.3測序結果 通過對酶切結果呈陽性樣本的PCR產物進行DNA直接測序，共檢出攜帶GJB2 235delC點突變56例，占56%。其中，26例為純合突變，30例為雜合突變，與酶切結果差異較小，見圖2。

圖2　測序圖

3　討論

GJB2基因全長為4804 bp，編碼區為678 bp，主要由兩外顯子組成，即一個外顯子1（exon1）和一個長蛋白編碼外顯子2（exon2），且編碼區主要存在于外顯子2上［17］。GJB2基因編碼產物為縫隙連接蛋白Connexin-26（Cx26），Cx26為跨膜蛋白，含5類結構域：N端結構域，2個細胞外結構域，4個跨膜結構域，C端結構域和胞質連接結構域。Cx26蛋白在細胞縫隙連接處以六聚體的形式形成穿膜通道，分布于耳蝸的血管紋、基底細胞、螺旋緣凸、神經感覺上皮及耳蝸傳導纖維等處，是細胞間電解質、第二信使和代謝物質的重要通道，在信息傳遞和物質交換中發揮重要作用［18］。

非綜合征性感音神經性耳聾主要由于GJB2基因突變引起，目前，經過臨床研究，在GJB2基因中已發現111中突變形式，顯性突變9種，隱性突變92種［4］。由于不同突變形式導致病變產生得原因有多種：由于起始密碼子的突變，即1A→G，將GJB2基因的起始密碼從Met變成Val，但是這種突變方式不合成蛋白質；堿基插入或缺失，如35delG，269insT，使GJB2基因發生移碼突變，Cx26蛋白的氨基酸序列發生變化，導致Cx26失活；基因突變后出現終止密碼子，如132G→A，導致突變后Trp（TGG）變成終止密碼子（TGA），從而終止蛋白質的合成。同樣，由于不同的GJB2基因突變引起不同的聽力衰減程度，即使在一個家庭中，攜帶相同基因突變的個體間同樣存在顯著差異。現階段，雖然還無法對不同GJB2基因突變所致的臨床癥狀下結論，但一些研究發現基因突變引起的臨床癥狀具有明顯特征。除此之外，GJB2基因中的隱形遺傳突變有可能發生在任何部位，而顯性遺傳突變，如125delAGG，會引起輕度到重度的聽力缺失，通常還會產生皮膚病癥。

遺傳基因的多態性并不伴隨著相應的遺傳性狀，主要是因為某個個體DNA分子結構的變化，并不改變基因的功能和表達性狀。通常在基因序列中，一些不參與蛋白質合成和無重要調節功能的區域發生突變會導致基因存在多態性，當這種突變獨立產生作用時，并不引起疾病。相對于其他基因，GJB2基因突變的多態性表達較高，所以要明確GJB2的基因突變屬于致病突變還是多態性表達是非常有必要的。現階段的臨床研究表明，在GJB2基因突變中，諸如G79A、A341G、T101C等在內的42種基因突變是多態性表達，其中仍有許多如109E-A突變等GJB2基因突變的歸類還存在許多爭議，這就需要更深一步的臨床研究和實驗進行驗證［19］。

對于生存習慣和環境不同的人群中，由GJB2基因突變造成的患兒聽力缺失的影響也不盡相同。研究發現，生活在北歐地區的高加索人中，將近20%的聽力缺失個體中發現有GJB2位點突變，在患語前聾聽力缺失的韓國人中為5%，以色列人為43%。在北歐猶太教徒、高加索人和加納人種中，在GJB2基因突變中，與聽力能力缺失相關且出現頻率較多的基因位點分別是35delG、167delT 和235delC。而在我國，235delC的突變情況在不同區域也不一樣，且純合子與雜合子之間的比例也有差異。研究統計顯示，東部235delC純合子及雜合子出現的次數較西部偏多；在大部分地區，235delC雜合子與純合子的比率大致相等。然而，部分區域，純合子與雜合子的比率相差較大，如北京、吉林等城市，235delC純合子頻率約是雜合子的二倍。并且在不同民族之間，235delC的突變情況也有顯著不同，如235delC等位基因突變在藏族出現的次數相對其他民族較低，而在滿族中頻率較高［20］。

多年臨床研究發現，感音性耳聾主要由GJB2基因突變造成，所以對有遺傳病史的家庭進行遺傳知識普及和教育并開展基因檢測，以及對遺傳性耳聾進行產前診斷是非常有必要的。

人的語言形成的關鍵時期是幼兒語前期，因此在新生兒的常規聽力檢查中，應增加GJB2基因檢測，便于早發現、早診斷、早干預以及早治療。對于一些產前診斷中，已經明確感音性耳聾的前提下，還可以通過遺傳學指導和手段干預下，進行二次生育，避免再次生育由于遺傳基因突變致聾的患兒。由于GJB2基因突變的類型多且雜，可通過對非綜合征性遺傳性耳聾患者的GJB2基因進行直接測序，在診斷出大多數已發現突變的同時，查出新的基因突變，為臨床診斷、治療提供理論支持和實驗研究。最后，相對遺傳性聾這一大類疾病來說，上述已經明確疾病表型和致病基因的病種只是其中很少一部分，遺傳性聾致病基因多且功能復雜，要實現從基因篩查到最終診斷的突破任重道遠，大部分遺傳性聾的明確基因診斷還依賴于未來臨床診斷水平、分子生物學水平以及生物信息學發展。隨著聽力學、影像學等臨床診斷技術不斷提高，同時分子生物學技術不斷發展使得基因篩查和檢測不但變得越來越便捷和可靠，而且能夠得到的遺傳數據也越來越大，隨著生物信息學的發展，這些大量篩查數據和成果的臨床指導價值也將逐步清晰化，屆時必將會有更多的遺傳性聾能夠完成明確的基因診斷［21］。

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SHI Zhi-lin，WANG Sha-yan，ZHANG Ruan-zhang.//Medical Innovation of China，2016，13（21）：021-024

Objective：To analyze GJB2 gene mutations in patients with non-syndrome children with neurosensory deafness，and ravel specific clinical manifestations of deafness gene and corresponding and provide a theoretical basis for genetic counseling，prenatal diagnosis and clinical treatment.Method：GJB2 gene was detected by polymerase chain reaction and direct sequencing of 50 patients with hereditary non syndrome deafness in Shenzhen and 100 healthy controls.Result：The 100 patients with 235delC GJB2 point mutations were detected by polymerase chain reaction and direct sequencing in 56 patients.Among them，26 cases were homozygous mutation，and 30 cases were heterozygous mutation.Conclusion：GJB2 gene mutation is one of the most important molecular causes of non syndrome children with nervous deafness，and the most common mutation type of GJB2 gene is 235delC，and itis of great significance for clinical detection of GJB2 gene.

Deafness； GJB2 gene； Gene mutation； PCR amplification； Restriction enzyme digestion analysis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.006

深圳市科技計劃項目（醫療衛生類）資助（200902004）
①廣東省深圳市第三人民醫院 廣東 深圳 518112
②廣東省深圳市人民醫院

石之驎

2016-01-16） （本文編輯：程旭然）