彌漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因檢測

翟玉娟王建波肖華靜趙 麗邱 瑩

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·論著·

彌漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因檢測

翟玉娟1王建波2肖華靜1趙 麗1邱 瑩1

目的： 檢測彌漫性掌跖角化病一家系中的KRT9基因突變情況。方法： 提取該家系中3例患者和3名家系正常成員及100名健康對照的外周血DNA，采取PCR擴增KRT9基因序列，ABI PRISM-3700測序儀檢測KRT9基因突變情況。結果： 該家系中3例患者存在KRT9基因上第487位C＞T突變，而該家系的正常成員及健康對照未檢測到突變。結論： KRT9基因突變C487T可能與本家系彌漫性掌跖角化病發病有關。

彌漫性掌跖角化病； 白癜風； 甲亢； 角蛋白9基因

彌漫性掌跖角化病是一種以手掌和足跖表皮角化過度為特征的難治性皮膚病，是掌跖角化病（palmoplantar keratoderm，PPK）中最常見的類型，為常染色體顯性遺傳。其又分為彌漫性表皮松解型掌跖角化病（diffuse epidermolytic PPK，DEPPK）和彌漫性非表皮松解型掌跖角化病（diffuse non-epidemaolytic PPK，DNEPPK），前者較為常見。DEPPK主要表現為手掌和足跖彌漫性角層增厚，病變部位周邊有明顯的紅斑邊緣，部分病例可伴有指關節墊［1，2］。

隨著遺傳學及分子生物學的發展，針對DEPPK致病基因的研究已取得很大進展。1992年，Reis等采用遺傳連鎖分析方法首次將德國一DEPPK家系的突變基因定位于17q12-q21，而后通過基因測序的方法證實DEPPK的致病基因即為位于該區域的KRT9基因［3，4］。隨后，國內外學者開展一系列不同DEPPK家系的KRT9基因檢測工作。迄今，已在不同DEPPK家系的KRT9基因中檢測到20余種不同的突變（www.Interfile.org），其中R163W最為常見［5］。目前報道的中國人DEPPK家系KRT9基因突變有以下幾種：N160S、R162Q、L167S、L159F、497delAinsGGCT、N160H和R163W［6］。

1　先證者資料

患者，男，29歲。掌跖角化過度29年，面部、四肢白斑4年，發現甲亢2年。患者出生后3個月掌跖部開始出現彌漫性角化，隨著年齡增加掌跖彌漫性角化過度明顯加重，局部色澤淡黃，表面光滑，多處皮損脫屑、皸裂。4年前手掌開始出現散在色素脫失斑，隨后半年內色素脫失斑先后累及足背、雙下肢和面部。2年前患者因雙下肢乏力查血 FT3：17.79 pmol/L （3.80～6.00 pmol/L），FT4：47.27 pmol/L（7.90～14.40 pmol/L），TSH：0.020 uIU/mL（0.340～5.600 uIU/ mL），被診斷為甲狀腺功能亢進癥（hyperthyroidism，簡稱甲亢）。體格檢查：一般情況好，各系統檢查未發現明顯異常。皮膚科檢查：掌跖可見彌漫性淡黃色角化增厚組織，界清，表面干燥、質硬，有少量脫屑和皸裂，角化性皮損邊緣有明顯紅斑（圖1a、b）。面部、雙手、雙下肢徑前和雙足背可見散在色素脫失斑，呈乳白色，大小不一，形狀多樣；雙手掌彌漫性色素脫失，并蔓延至雙手腕部（圖2a、b）。診斷：（1）彌漫性掌跖角化病；（2）白癜風；（3）甲狀腺功能亢進癥。

圖1　a：雙手掌彌漫性淡黃色角化增厚組織并色素脫失；b：雙足掌彌漫性淡黃色角化增厚組織 圖2 a：雙手背彌漫性乳白色色素脫失斑；b：雙足背散在乳白色色素脫失斑

2　家系調查

父母非近親結婚，家族四代共有彌漫性掌跖角化病13例，男6例，女7例，發病時間均為出生后3個月左右，皮損均表現為掌跖彌漫性角化過度。目前未發病者其子代均正常，發病無性別差異，無隔代遺傳現象，符合常染色體顯性遺傳（圖3）。另外，所有家族成員中除先證者外，無患白癜風或甲亢者。

3　家系角蛋白9基因檢測

3.1實驗方法 在簽署書面知情同意書后，對先證者（III 4）和其家系中另外2例患者（III 2、IV 2）和3例未患病成員（II 9、III 5、III 12）進行血樣采集，每例抽取外周血3 mL。應用QIAamp DNA blood mini kit（德國Qiagen公司）提取基因組DNA。另外，以同樣的方法提取100例無親緣關系的健康對照個體基因組DNA作為對照。通過美國國立圖書館網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查取角蛋白9（keratin 9，KRT9）基因mRNA序列，經BLAST比對得到該基因的基因組序列（http：//www.Genome.UCSC.edu/），應用Primer 3.0設計特異性引物對KRT9基因8個外顯子進行 PCR擴增，擴增產物純化后直接在 ABI PRISM-3700測序儀（Applied Biosystems）上進行測序，測序結果與人類基因組KRT9序列進行比較，同時使用Phred-Phrap-Consed軟件包Versionl 2.0進行分析。

3.2結果 PCR產物經測序發現，3例患者KRT9基因的第487位堿基胞嘧啶（C）轉化成胸腺嘧啶（T），使得KRT9基因的第1號外顯子163位密碼子由CGG突變成TGG，導致正常的精氨酸（Arginine，Arg）由色氨酸（Tryptophan，Trp）替代（圖4）。家系中3名正常人及100名無親緣關系的正常人均未見其改變，通過 Polyphen2.0（http：//genetics.bwh.harvard.edu/ pph2/）對突變蛋白結構預測得分為1.0，可能是致病的突變。

圖3　患者家系圖

圖4　先證者及家系中正常人KRT9基因第1外顯子部分測序結果

4　討論

本家系的突變位點即是 DEPPK中最常見的R163W突變，即487 C＞T突變使得KRT9基因的第1外顯子163位密碼子由CGG突變成TGG，導致正常的精氨酸被色氨酸替代。有研究表明，KRT9棒狀功能域的1Aa螺旋區的前15個氨基和2Ba螺旋區末端的10～11個氨基酸對角蛋白中間絲的聚集和穩定至關重要［1］。163位是棒狀功能域1Aa螺旋區的第12位氨基酸，因此R163W突變將影響角蛋白中間絲的聚集，破壞中間絲網狀系統的形成，從而導致該病的發生。另外，有研究發現角蛋白1（Keratin l，KRT1）基因突變也可以引起DEPPK，目前證實的KRT1基因突變有4種：I497T、L437P、S223L和F231L［7-9］。

先證者從臨床特征看為DEPPK，而且本家系的突變位點也是DEPPK中最常見的R163W突變（新版本的角蛋白9序列發表于 2005年4月23日［gi：55956898］，突變R162W更換為R163W）。但先證者同時伴發白癜風和甲亢實屬罕見。通過文獻檢索后確定，目前為止本病例三病共發于一個體現象應為首次報道。2004年馮蘭珍等［10］曾報道殘毀性掌跖角化病伴白癜風一例，其白癜風皮損在患者腹部，不與掌跖角化皮損重合，此與本病例不同。掌跖角化病患者皮損過度角化，出現嚴重脫屑或皸裂，皮損中炎性細胞浸潤較多時有可能損傷到黑素細胞，導致黑素細胞密度降低或脫失，從而導致繼發性白癜風。但臨床上掌跖角化病合并白癜風的患者確為少數，兩者并發也很可能是隨機事件。然而，白癜風合并甲亢已多有報道。目前研究認為，白癜風和甲亢均為與遺傳相關的自身免疫性疾病，并有學者通過調查認為白癜風和甲亢患者中兩者并發率高達25%［11］；在國內，有學者研究發現兩者并發率為8.2%［12］。最新研究證實，白癜風和自身免疫性甲狀腺病存在相關致病基因，即NLRP1基因［13］。故有學者提出對白癜風患者應該常規篩查甲狀腺疾病［14］。

總之，先證者為三病并發的特殊病例，KRT9基因R163W突變是此DEPPK家系的明確致病因素，先證者DEPPK與白癜風發病可能存在繼發或加重影響因素，與甲亢則可能為相互獨立事件，而白癜風與甲亢相互伴發的現象提示臨床工作中應重視和建立兩病相互伴發的篩查意識。

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（收稿：2016-02-01 修回：2016-02-16）

Mutations of keratin 9 gene in one family with diffuse plamoplantar keratoderma

ZHAI Yujuan1，WANG Jianbo2，XIAO HuaJing1，ZHAO Li1，QIU Ying1.
1.Department of Dermatology，Jining No.1 People's Hospital，Jining 272000，Shandong，China；2.Department of Dermatology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，China
Correspondence author：QIU Ying，E-mail：qiuyingjn@163.com

Objective：To identify mutations of keratin 9 gene（KRT9）in a family with diffuse plamoplantar keratoderma（DPPK）.Methods：DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in a family （3 patients and 3 normal members）and 100 healthy controls.All the exons of KRT9 were amplified by PCR and direct DNA sequencing was performed by ABI PRISM-3700 sequenator.Results：A missense mutation （487C＞T）in the KRT9 gene was identified in the three patients and none of mutation was found in 3 normal family members and healthy controls.Conclusion：The mutation of C487T in KRT9 gene is associated with the onset of diffuse palmoplantar keratoderma in the family.

diffuse plamoplantar keratoderma；vitiligo；hyperthyroidism；KRT9 gene

邱瑩，E-mail：qiuyingjn@163.com

1濟寧市第一人民醫院，山東濟寧，272000

2河南省人民醫院皮膚科，河南鄭州，450003