液體培養(yǎng)法、PCR法和SAT法在解脲支原體檢測中的應(yīng)用比較

曾成龍 馮 婷 閆 丹 王勝春

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·論著·

液體培養(yǎng)法、PCR法和SAT法在解脲支原體檢測中的應(yīng)用比較

曾成龍 馮 婷 閆 丹 王勝春

目的： 比較液體培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（SAT）在解脲支原體（Uu）檢測中的診斷價值。方法： 應(yīng)用液體培養(yǎng)法、PCR法和SAT法對77例疑似男性泌尿生殖系統(tǒng)感染患者尿道和23例女性宮頸的分泌物進行解脲支原體的檢測。結(jié)果： 100例患者中陽性29例（29.00%），其中男15例，感染率19.48%（15/77），女14例，感染率60.87%（14/23）。SAT法的敏感性為100%高于液體培養(yǎng)法（89.66%）和PCR法（86.21%），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），SAT法的特異性為84.50%低于液體培養(yǎng)法（98.59%）和PCR法（98.59%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論： 以上三種方法均可用來檢測Uu，SAT敏感性強，特異性低，適用于檢測病原微生物含量不高的標(biāo)本。

液體培養(yǎng)法； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)； 解脲支原體

目前解脲支原體（Uu）檢測方法多采用液體培養(yǎng)法，它是通過Uu分解不同底物改變液體培養(yǎng)基pH，使培養(yǎng)基顏色變化，間接判斷其生長同時進行藥敏試驗。但能分解尿素的細(xì)菌都可導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，例如流感嗜血桿菌、克雷伯氏菌、乳酸菌種、變形桿菌、耐苯唑西林金黃色葡萄球菌等［2］，故單純依靠顏色的變化來判斷會存在假陽性，必須配合其他的檢測手段才能確定結(jié)果是否準(zhǔn)確［3］。目前市場上出現(xiàn)以實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)（Simultaneous Amplification and Testing，簡稱SAT）作為手段的試劑產(chǎn)品，本研究特對100例疑似泌尿生殖系統(tǒng)感染患者，采集男性尿道或女性宮頸分泌物，同時應(yīng)用液體培養(yǎng)法、PCR法和SAT法進行Uu的檢測，對這3種方法的診斷價值進行比較，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 2015年2月～6月STI門診疑似泌尿生殖道感染患者共 100例，其中男77例（77.00%），女23例（23.00%）；年齡18～78歲，平均（35.52±11.57）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）近期有過不安全性接觸患者；（2）有泌尿生殖道感染臨床癥狀；（3）患有其他性病而來醫(yī)院查體患者，排除1周內(nèi)已使用相關(guān)藥物進行治療的患者。

1.2取材 用消毒棉拭子伸入男性尿道約2～4 cm，女性宮頸管內(nèi)1～2 cm進行取材。第一個棉拭子立即接種培養(yǎng)，第二個棉拭子洗滌于裝有1 mL生理鹽水的EP管，第三個棉拭子生理鹽水洗脫后，倒入尿樣保存管，將EP管和尿樣保存管于-20℃冰箱保存。

1.3試劑和方法 液體培養(yǎng)法試劑生產(chǎn)廠商是法國Biomerieux'SA，實時熒光定量PCR方法試劑盒由泰普生物工程有限公司提供，SAT法試劑生產(chǎn)廠商是上海仁度生物科技有限公司，PCR儀器TL988由西安天隆科技有限公司提供。

1.4操作 嚴(yán)格按試劑盒說明書進行各項操作。

1.5結(jié)果判定 以2種以上（包括2種）檢測方法的結(jié)果均陽性為真陽性，結(jié)果均陰性為真陰性。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1檢測結(jié)果 100例患者中，Uu真陽性 29例（29.00%），其中男15例，感染率19.48%（15/77）；女14例，感染率60.87%（14/23），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與以往文獻報道一致［3］。

2.23種方法檢測解脲支原體的結(jié)果比較 見表1。

表1　3種方法檢測解脲支原體的結(jié)果比較 例

2　討論

Uu是人類泌尿生殖道的常見病原體，已作為臨床常規(guī)檢測項目，越來越多的檢測方法也逐漸被人們探索、建立和成熟，為臨床診斷提供著愈加可靠的信息［4］，故本研究選擇Uu作為實驗項目進行多種方法學(xué)比較研究。目前臨床上Uu的檢測方法是液體培養(yǎng)法和檢測病原體DNA的PCR法，液體培養(yǎng)法操作簡便且能同時進行藥敏試驗，包括基層在內(nèi)的大部分醫(yī)院普遍使用；PCR技術(shù)能快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢出病原體的DNA，技術(shù)條件符合的醫(yī)院都有開展。SAT法是將核酸恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)，它的原理是在42℃條件下，首先將提取的靶標(biāo)核酸（RNA）通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝，每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光，該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，達(dá)到檢測目的［5］。該技術(shù)在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于檢測Ct、Uu、NG、Mg、Mp、EV和EV71等。

SAT法其靶標(biāo)為RNA，初始模板數(shù)量大，因為一個病菌內(nèi)有10000多條16sr RNA，而且每條RNA又可以擴增100～1000條，故具有高敏感性，從原理上可知，培養(yǎng)法和PCR法敏感性低于SAT法，和本研究結(jié)論一致。SAT法其靶標(biāo)和核酸產(chǎn)物均為RNA，均為特異性提取、擴增和檢測，特異性高［3］，但本研究液體培養(yǎng)法和PCR法的特異性更高，SAT特異性稍差。SAT法的特點還在于它檢測的是病原體16s rRNA，因活菌中才有完整的RNA片段，因此相當(dāng)于檢測活菌，有利于臨床用藥后的療效監(jiān)測。RNA在環(huán)境中極不穩(wěn)定，容易降解，大大降低了核酸擴增檢測交叉污染引起的假陽性問題，污染概率?。?］。總之，以上三種方法均可用來檢測Uu，SAT技術(shù)敏感性強，容易出現(xiàn)假陽性，應(yīng)用SAT法注意結(jié)合臨床辨別假陽性，尤其是無癥狀患者和已治療但未完全清除的患者，往往需要其他檢測方法進行復(fù)查。目前臨床上Uu檢測方法使用最多的還是液體培養(yǎng)法和PCR法，而SAT法更適合應(yīng)用于檢測標(biāo)本中含量不高的病原微生物，例如分枝桿菌和生殖支原體等［7］。

［1］Vancutsem E，Soetens O，Breugelmans M，et al.Modified real-time PCR for detecting，differentiating，and quantifying Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum［J］.J Mol Diagn，2011，13（2）：206-212.

［2］劉會彩.不育男性精子形態(tài)和解脲支原體感染的相關(guān)性研究［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2015，12（15）：2208-2209.

［3］張睿，葉阿里，孔令君，等.臨床患者三種性傳播疾病分子生物學(xué)檢測分析［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（3）：107-108.

［4］張艷，李蘇利.解脲支原體檢測方法研究現(xiàn)狀［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2014，42（9）：961-963.

［5］王永忠，張宏宇，劉小琴.痰液標(biāo)本結(jié)核分支桿菌RNA恒溫擴增檢測及臨床應(yīng)用［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（41）：83-84.

［6］張津萍，龔匡隆，尤永燕，等.實時熒光核酸恒溫擴增法檢測泌尿生殖道淋球菌感染［J］.國際皮膚性病學(xué)雜志，2010，36（3）：137.

［7］Cui Z，Wang Y，F(xiàn)ang L，et al.Novel real-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detect mycobacterium tuberculosis complex［J］.J Clin Microbiol，2012，50（3）：646-650.

（收稿：2016-01-05 修回：2016-03-02）

Comparison of SAT，Liquid culture and PCR in detection of ureaplasma urealyticum

ZENG Chenglong，F(xiàn)ENG Ting，YAN Dan，WANG Shengchun.
Army Skin Disease Research Institute，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710032，China
Corresponding author：WANG Shengchun，E-mail：wangsc@fmmu.edu.cn

Objective：To compare the application of liquid culture，PCR and SAT in the diagnosis of Ureaplasma urealyticum（Uu）.Methods：Uu was detected from specimens of 77 males'urethra and 23 females' cervix by liquid culture，PCR and SAT.Results：The Uu was detected in 100 specimens，giving a positivity rate of 29%.Out of the 29 positive specimens，15（19.48%）were from males and 14（60.87%）were from females.The sensitivity of SAT was 100%which was higher than liquid culture（89.66%）and PCR （86.21%）.However，there were no significant differences among the three methods（P＞0.05）.The specificity of SAT was 84.50%which was lower than liquid culture（98.59%）and PCR（98.59%），with significant differences（P＜0.05）.Conclusion：Liquid culture，PCR and SAT can be used in the detection of Uu.SAT has higher sensitivity and lower specificity，which is more suitable for detecting low concentration of Uu.

Liquid culture；PCR；SAT；ureaplasma urealyticum

王勝春，E-mail：wangsc@fmmu.edu.cn

第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，西安，710032