真核細胞翻譯起始因子4E在皮膚基底細胞癌中的表達

鄧 越 劉海東 莊 樂 馬偉元

?

·論著·

真核細胞翻譯起始因子4E在皮膚基底細胞癌中的表達

鄧 越 劉海東 莊 樂 馬偉元

目的： 檢測皮膚基底細胞癌中真核細胞翻譯起始因子4E（eIF4E）的表達。方法： 采用免疫組化PV-9000法和Real-time PCR法分別檢測20例皮膚基底細胞癌及20名健康皮膚組織中eIF4E蛋白及mRNA的表達。結果： 基底細胞癌和健康皮膚組織中eIF4E蛋白MOD值分別為（0.198± 0.031）和（0.096±0.015），mRNA相對表達量分別為（2.32±1.00）和（1.24±0.17），差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論： eIF4E可能參與皮膚腫瘤的發病過程。

基底細胞癌； 真核細胞翻譯起始因子4E； 免疫組化； 實時熒光定量PCR

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 收集2014年1月至2015年1月山東大學齊魯醫院皮膚科病理室診斷的BCC蠟塊標

本20例。其中男女各半，年齡59～74歲，中位年齡68歲，病史1個月～12年。發病部位均為顏面部，其中眼周4例，鼻翼5例，鼻唇溝4例，面頰5例，顳部2例。病理分型：結節潰瘍型9例，色素型5例，淺表型3例，硬皮病樣型1例，腺樣型2例。另取皮膚外科術中廢棄的健康皮膚標本20例作為對照組，兩組在年齡、性別、取材部位上相匹配。

1.1.2主要試劑 濃縮型兔抗人eIF4E多克隆抗體（貨號：ab76256，規格：100 μL/支）購于美國Abcam生物工程有限公司，二步法免疫組化試劑盒（貨號：PV-9000，規格：5 mL/支）、DAB顯色液（貨號：ZLI-9019，規格：10 mL/瓶）購于北京中杉金橋生物技術有限公司。離心柱型石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒（貨號：RP5321，規格：50次）、Super M-MLV反轉錄酶（貨號：PR6502，規格：10000 U）、2×Super SYBR real-time PCR premixture（貨號：PR7031，規格：125次）購于北京百泰克生物技術公司，其它實驗用品由山東大學齊魯醫院皮膚科實驗室提供。

1.2方法

1.2.1免疫組化法檢測eIF4E蛋白的表達 蠟塊3 μm厚連續切片，常規脫蠟至水，EDTA（PH=9.0）修復液高溫高壓修復3.5 min，4℃冷卻1 h。3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，山羊血清37℃封閉20 min。滴加兔抗人eIF4E多克隆抗體（工作濃度為1∶50），4℃孵育過夜。嚴格按照PV-9000試劑盒說明書中步驟滴加二抗。顯微鏡控制DAB顯色，自來水終止顯色反應。蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

結果判定：由兩位高年資病理醫師進行，每張切片隨機選取5個不連續具有代表性的高倍鏡視野（40×）進行拍照，曝光條件均一致，OLYMPUS-DP2-BSW全自動圖像分析系統進行彩色圖像的采集與儲存。用image pro-plus 6.0專業圖像分析軟件對圖像進行半定量分析，計算出每張切片的平均光密度值MOD，MOD=sum（IOD）/sum（area）。MOD值越高，表達越強。

1.2.2Real-time PCR法檢測eIF4E mRNA的表達

①RNA提?。喊碦NA提取試劑盒說明書提取健康對照皮膚及基底細胞癌中的總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量和純度；②cDNA鏈合成：逆轉錄反應體積為20 μL，包括經檢測合格的RNA 0.5 μg、隨機引物200 μg、50 μM oligo（dT）1 μL、5×Reaction Buffer 4 μL、10 mM dNTP Mix 2 μL、RNase-free ddH2O 10 μL、Thermo M-MLV（200 U/μL）1 μL，反應條件：25℃ 10 min，42℃50 min，反應產物-80℃保存備用；③熒光實時定量PCR：引物由上海生工生物工程有限公司合成，內參基因GAPDH擴增產物226 bp；eIF4E mRNA擴增產物246 bp（表1）。

表1　eIF4E、GAPDH擴增引物序列表

實時定量PCR：使用定量PCR反應儀檢測，采用20 μL反應體系。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行如下反應：95℃起始模板變性2 min（1循環），95℃模板變性15 s，65℃退火、延伸40 s收集熒光信號（40循環），實驗重復3次取平均值，得到每個標本不同指標的Ct值，以GAPDH mRNA的量為內參照，根據公式2-△△Ct計算出所測指標的相對表達量（表2）。

表2　定量PCR反應儀所測指標相對表達量

2　結果

2.1eIF4E蛋白的表達 eIF4E在健康對照皮膚的表皮中未見表達（圖1a），其MOD值為（0.096±0.015）；基底細胞癌腫瘤團塊陽性表達率為95%（19/20），eIF4E主要定位于細胞漿中，部分細胞核中亦有表達，呈彌散性或散在性分布的棕黃色顆粒（圖1b），MOD值為（0.198±0.031）。由此可見，基底細胞癌中eIF4E蛋白的表達較健康皮膚明顯上調，差異具有顯著性意義（t=-13.497，P＜0.05）。

圖1　a：eIF4E蛋白在健康皮膚表達陰性；b：基底細胞癌皮損中表達陽性（PV-9000，×400）

2.2eIF4E mRNA的表達 eIF4E mRNA在基底細胞癌中呈現高表達（2.32±1.00），在健康皮膚組中呈現低表達（1.24±0.17），兩者比較差異具有統計學意義。（t=-4.807，P＜0.05）。

3　討論

eIF4E在多種實體腫瘤中呈現過表達，過表達eIF4E通過選擇性地增加某些增殖相關基因和促生存基因（如c-myc、cyclinD1、ODC、VEGF、FGF2）的mR-NA翻譯來促使細胞表型的轉變［9］。目前研究主要發現兩種作用機制：①eIF4E因子可特異性的與真核細胞mRNA的5'末端帽結構結合，參與mRNAs向核糖體的物質轉運；②eIF4E可顯著增加eIF4A解旋酶的活性［10］，eIF4E和eIF4A因子可協同解開mRNA 5' UTRs二級結構［11］，從而啟動特定mRNA的翻譯，顯著改變細胞的表型，促進細胞增殖和誘導細胞轉化腫瘤形成和轉移［12］。但有關皮膚腫瘤，特別是基底細胞癌中eIF4E的表達情況，迄今尚未見國內外報道。

本研究表明，eIF4E蛋白和mRNA在BCC組織中呈高表達，由此推測其可能參與BCC的發病過程。大量研究認為引起BCC發病的最主要誘因是日光中UV導致的 DNA分子破壞從而觸發 p53凋亡通路［13］，而Akt/mTOR通路拮抗p53的促凋亡作用，當其調節失控時就會促進細胞的轉型和異常增殖［14］，因此BCC的發生與mTOR信號通路調節異常密切有關。已有研究證實eIF4E能夠上調Akt蛋白的表達［13］，推測其可能作為mTOR信號通路的重要靶點。其次，eIF4E亦能調節 VEGF、Cyclin D1因子的表達［17］，抑制細胞凋亡，促進內皮細胞的形成，促進血管生成和腫瘤生長［15］。以上推測可能是 eIF4E在BCC發病過程中的作用機制，我們將在今后進行進一步的實驗研究。

［1］Grant DJ，Ernest PW，Allen RP，et al.The alveolate translation initiation factor 4E family reveals a custom toolkit for translational control in core dinoflagellates［J］.BMC Evol Biol，2015，15（1）：14.

［2］呂紅瓊，張華，王平，等.原癌基因eIF4E與bFGF在乳腺癌中的表達及其臨床意義［J］.實用腫瘤學雜志，2007，21 （4）：306-309.

［3］Mona DA，Raefa AK，Nina SZ，et al.Expression of eukaryotic initiation factor 4E and 4E binding protein 1 in colorectal carcinogenesis［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（1）：404-413.

［4］Wang R，Geng J，Wang JH，et al.Over expression of eukaryotic initiation factor4E（eIF4E）and its clinical significance in lung adenocarcinoma［J］.Lung Cancer，2009，66 （2）：237-244.

［5］Luc F，Liwei Rong，Ola L，et al.eIF4E phosphorylation promotes Tumorigenesis and is associated with prostate cancer progression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（32）：14134-14139.

［6］Songqing F，Suresh SR，John K，et al.Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4（eIF4E）is elevated in human cancer tissues［J］.Cancer Biol Ther，2009，8（15）：1463-1469.

［7］Chantal SC，Antisar BK，Simon HR，et al.CD200-expressing human basal cell carcinoma cells initiate tumor growth ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（4）：1434-1439.

［8］Lyubomir AD，Darena R，Ivan B.Clinical variants，stages，and management of basal cell carcinoma［J］.Indian Dermatol Online，2013，4（1）：12-17.

［9］Muta D，Makino K，Nakamura H，et al.Inhibition of eIF4E phosphorylation reduces cell growth and proliferation in primary central nervous system lymphoma cells［J］.J Neurooncol，2011，101（1）：33-39.

［10］Kateryna F，Enkhee T，Angelie D，et al.Human eIF4E promotes mRNA restructuring by stimulating eIF4A helicase activity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（33）：13339-13344.

［11］Greco H，Hong Han，Valentina G，et al.Eukaryotic initiation factor 4E-3 is essential for meiotic chromosome segregation，cytokinesis and male fertility in drosophila［J］.Development，2012，139（17）：3211-3220.

［12］Ivan T，Nadeem S，Vincent LL，et al.Molecular dissection of the eukaryotic initiation factor 4E（eIF4E）export-competent RNP［J］.EMBO J，2009，28（8）：1087-1098.

［13］Gallagher RP，Hill GB，Bajdik CD，et al.Sunlight exposure，pigmentary factors，and risk of nonmelanocytic skin cancer.I.Basal cell carcinoma［J］.Arch Dermatol，1995，131（2）：157-163.

［14］Alexander GM，Samuel EB.Basal cell carcinoma：Pathogenesis，epidemiology，clinical features，diagnosis，histopathology，and management［J］.Yale J Biol Med，2015，88 （2）：167-179.

［15］張桂英，周雙元，姚明珠，等.Akt和mTOR在皮膚基底細胞癌中的表達［J］.中華皮膚科雜志，2010，43（6）：426-427.

［16］Jeremy RG，Bruce WK，Thomas MV，et al.Therapeutic suppression of translation initiation factor eIF4E expression reduces tumor growth without toxicity［J］.J Clin Invest，2007，117（9）：2638-2648.

［17］吳文藝，張麗婷，鄭志芳，等.eIF4E、p-eIF4E和Mcl-1在病理性瘢痕組織中的表達和意義［J］.中華整形外科雜志，2012，28（5）：360-365.

（收稿：2015-12-07 修回：2015-12-30）

Expression of eIF4E in basal cell carcinoma

DENG Yue1，LIU Haidong2，ZHUANG Le2，MA Weiyuan2.
Department of Dermatology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China Corresponding author：MA Weiyuan，E-mail：dermatologyqlh@163.com

Objective：To detect the expression of eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E）in basal cell carcinoma（BCC）.Methods：The protein and mRNA expressions of eIF4E were detected by PV-9000 immunohistochemistry and real-time PCR in 20 patients with basal cell carcinoma and 20 healthy controls.Results：The MODs in BCC and controls were 0.198±0.031 and 0.096±0.015 respectively and the expression levels of mRNA were 2.32±1.00 and 1.24±0.17，with significant differences（P＜0.05）. Conclusion：eIF4E may involve in the pathogenesis of BCC.

basal cell carcinoma；eIF4E；immunohistochemistry；RT-PCR真核細胞翻譯起始因子4E（eukaryotic initiation factor-4E，eIF4E）是一種25KD的多肽，是真核細胞翻譯起始和調控的核心部分，在蛋白質的翻譯起始過程中發揮重要作用［1］。研究表明eIF4E在多種實體腫瘤（例如乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌、子宮頸癌、白血病等）中高表達，與腫瘤的侵襲和轉移呈現正相關［2-6］。基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）占所有皮膚惡性腫瘤的70%［7］，雖發展較慢，很少發生遠處轉移（＜0.5%），但可引起嚴重的局部組織損壞［8］，加之其病因復雜，臨床及病理表現多樣，值得進行深入而系統的研究。本研究對eIF4E蛋白和mRNA在皮膚基底細胞癌中的表達水平進行研究，旨在初步探討其在BCC發病中的作用。

馬偉元，E-mail：dermatologyqlh@163.com

2014年山東省自然科學基金（編號：ZR2014HP007）

山東大學齊魯醫院皮膚科，濟南，250012