HPLC測定經不同益生菌發酵前后黃芪中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量

林莎莎，周洪雷*，孫筱林，池雨鋒，蔣海強，張玲，楚新紅

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.三株醫藥生物研究所，山東 濟南 250100)

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HPLC測定經不同益生菌發酵前后黃芪中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量

林莎莎1，周洪雷1*，孫筱林2，池雨鋒1，蔣海強1，張玲1，楚新紅2

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.三株醫藥生物研究所，山東 濟南 250100)

摘要：采用HPLC-ELSD法測定黃芪經不同益生菌株發酵前后的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量變化。色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),采用乙腈-水為流動相，梯度洗脫，流速為：1 mL/min。結果表明，黃芪對照中黃芪甲苷和皂苷Ⅱ的含量分別為0.476 2 mg/g和0.050 3 mg/g。用混合菌種發酵后黃芪甲苷和皂苷Ⅱ的含量分別為0.257 8 mg?g和0.109 4 mg?g。黃芪經益生菌發酵后黃芪甲苷含量降低而皂苷Ⅱ的含量升高，且不同菌種發酵后的黃芪甲苷和皂苷Ⅱ的含量也有差異。

關鍵詞：黃芪;益生菌發酵;HPLC-ELSD;黃芪甲苷;黃芪皂苷Ⅱ

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。黃芪的主要化學成分有皂苷、黃酮和多糖等。藥理研究表明，大劑量的黃芪總皂苷有強心苷樣的作用，還能夠降低老年大鼠全血比粘度、血漿比粘度以及紅細胞壓積[2],發揮明顯抗血栓的作用[3]。其中黃芪甲苷有明顯的正性肌力作用，能改善心臟收縮和舒張的功能[4]。還有研究發現，黃芪皂苷Ⅱ對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/FU有逆轉耐藥作用[5]。

發酵是傳統中藥加工炮制的重要方法。微生物發酵能增強中藥的藥效，具有改變藥效物質、減毒增效等作用[6]，目前微生物發酵技術已經成為中藥現代化研究的重要內容。本文采用不同益生菌株對黃芪進行發酵，采用HPLC方法對黃芪甲苷和皂苷Ⅱ進行了含量測定，為黃芪的臨床用藥及發酵中藥的研究提供了科學的依據。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695高效液相色譜儀,Waters 2424 ELSD Detector(美國Waters)；ES-J120電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；HH恒溫水浴鍋(江蘇金壇市中大儀器廠)；OSB-2100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司);KQ5200DB型超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥

黃芪(批號1504134111，購自安國市祁澳中藥飲片有限公司)。黃芪液及黃芪發酵液(濟南三株集團醫藥生物研究所)。對照品黃芪皂苷Ⅱ(H-037-130428)、黃芪甲苷(H-013-150626)，純度均大于98%(成都瑞芬思生物科技有限公司)。乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件

Waters e2695 HPLC；Waters 2424 ELSD Detector；Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水，梯度洗脫，見表1；進樣量33 μL，流速為1.0 mLmin；檢測器條件：漂移管溫度為60 ℃，增益10，氣壓為25 Psi(1 Psi=6 895 Pa)，霧化器為加熱，動力水平為60%。

表1　黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的梯度洗脫條件

2.2對照品溶液的制備

精密稱定干燥至恒重的黃芪甲苷4.20 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配成濃度為0.42 mgmL的標準品溶液。精密稱定干燥至恒重的黃芪皂苷Ⅱ對照品7.86 mg，甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配成濃度為0.786 mgmL的標準品溶液。分別精密量取黃芪甲苷對照品溶液2 mL和黃芪皂苷Ⅱ對照品溶液1 mL定容于10 mL容量瓶中配成黃芪甲苷對照品溶液0.084 mgmL，黃芪皂苷Ⅱ對照品溶液0.078 6 mgmL的混合標準品溶液。

2.3黃芪發酵液的制備

黃芪粉碎，過10目篩，取120 g，分成4份，加11.5倍量的水，浸泡，調pH中性，121 ℃滅菌60 min，冷卻后接種預培養的益生菌，37 ℃發酵，期間調控pH，繼續發酵至96 h。結束發酵后，加熱煮沸，離心，離心液定容至1 200 mL，115 ℃滅菌50 min備用。黃芪對照液的制備過程同上，但不接種益生菌。

表2發酵黃芪樣品說明

2.4供試品溶液的制備

精密量取各黃芪發酵液20 mL(相當于黃芪藥材2 g)，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇層，蒸干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.5線性關系的考察

取黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的混合對照品溶液,分別進樣3、5、10、15、20、25、30 μL，按2.1色譜條件測定，記錄峰面積的積分值。以進樣量(μg)的常用對數值為橫坐標，峰面積的積分值的常用對數值為縱坐標，測得線性方程。黃芪甲苷：Y=1.284 9X+6.985 3，R=0.999 6，線性范圍為0.252 0～2.520 μg；黃芪皂苷Ⅱ：Y=1.383 2X+6.869，R=0.999 6，線性范圍為0.235 8～2.358 μg。

2.6精密度實驗

吸取黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ混合對照品溶液15 μL，連續重復進樣5次，測得黃芪甲苷峰面積的RSD為0.64%，黃芪皂苷Ⅱ峰面積的RSD為0.57%，結果表明儀器精密度良好。

2.7重復性實驗

取黃芪液，精密量取5份，每份10 mL，按照2.4項下供試品溶液的制備方法，分別制備供試品液，按2.1項的色譜條件測定。結果表明黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量的RSD分別為2.0%和1.9%，表明本方法重復性良好。

2.8穩定性實驗

取供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、6、12、24 h進樣測定，結果表明黃芪甲苷峰面積RSD值為1.4%，黃芪皂苷Ⅱ峰面積的RSD為1.5%，表明樣品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.9加樣回收率實驗

精密量取混合菌發酵黃芪液6份，每份10 mL(相當于1 g黃芪藥材)，分別精密加入黃芪甲苷對照品0.252 0 mg，黃芪皂苷Ⅱ對照品0.110 0 mg。按照2.4項要求制備供試品溶液。按照2.1項色譜條件進樣，得到黃芪甲苷的回收率為99.69%，RSD為2.0%，黃芪皂苷Ⅱ的回收率為100.42%，RSD為2.3%。

2.10樣品的含量測定

精密量取各黃芪發酵液20 mL按照2.4項要求制備供試品溶液，按照2.1項色譜條件測定，計算黃芪液中的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量(折合成每克藥材的含量)。結果見表3，色譜圖見圖1。

表3　黃芪發酵前后黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量測定結果

1號峰為黃芪甲苷　　2號峰為黃芪皂苷Ⅱ圖1　HPLC圖Fig.1　HPLC map

3　討論

實驗結果表明，黃芪液中黃芪甲苷的含量為0.476 2 mgg，黃芪經過各種益生菌發酵后黃芪甲苷的含量明顯降低，其中混合菌發酵黃芪液中黃芪甲苷的含量最低為0.257 8 mgg，含量降低了45.86%。黃芪對照液中黃芪皂苷Ⅱ的測得含量為0.050 3 mgg，黃芪經短雙歧桿菌和混合菌發酵后黃芪皂苷Ⅱ的含量分別為0.106 4 mgg和0.109 4 mgg，黃芪皂苷Ⅱ的含量分別增加了52.73%和54.02%。

不同的益生菌發酵的結果不同[7]。短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌以及混合菌種有各自的生物轉化機制，這些機制可能為:發酵菌種以黃芪甲苷或者一些非有效成分為前體進行代謝或轉化成新的活性成分，從而使黃芪甲苷含量降低；不同的益生菌在發酵過程中產生的初生代謝產物、次生代謝產物與黃芪甲苷或者黃芪藥材中的某些物質產生了化學反應，生成了新的物質；黃芪中的某些物質可能對不同益生菌的生長或代謝產生促進或抑制作用，且對不同益生菌的促進或抑制的程度不同，從而改變了黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ，以及其他活性成分的比例[8]。

微生物發酵不僅改變了中藥的活性成分，進而也改變了中藥的臨床療效，使中藥能在外觀和口感上更好地被病人接受，該技術為中藥的開發與利用提供了新的思路和方法。本文采用HPLC-ELSD法，以乙腈-水作為流動相，對發酵前后的黃芪中的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ進行含量測定，靈敏度高、分離度好、操作處理簡單且重現性好，回收率高，是一種良好的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的測定方法。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:283.

[2]蔣斗發,殷昌好,俞能高,等.黃芪總皂苷對老年大鼠血液流變性的影響[J].基層中藥雜志,2002,16(5):15-16.

[3]高建,徐先祥,徐先俊,等.黃芪總皂苷抗血栓形成作用實驗研究[J].中成藥,2002,24(2):116-118.

[4]劉艷霞,劉在萍,焦建杰,等.黃芪苷Ⅳ對正常和心功能受抑制大鼠左心室心肌力學的影響[J].中草藥,2001,32(4):332-334.

[5]王培培,許杜娟,黃燦,等.黃芪皂苷Ⅱ對人肝癌多藥耐藥細胞BEL-7402/FU的逆轉耐藥作用.[J].中藥臨床藥理學與治療學,2014,19(2):139-144.

[6]耿欣.發酵技術在中藥研究中的應用[J].中醫藥信息,2011,28(4):149-150.

[7]李崗,周洪雷,史玉霞,等.不同制備工藝消栓口服液發酵前后HPLC指紋圖譜的比較研究[J].時珍國醫國藥,2015,26(5):1127-1130.

[8]孫靜,馬琳,呂斯琦，等.中藥發酵技術研究進展[J].藥物評價研究,2011,34(1):49-51.

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.004

收稿日期：2015-12-28

基金項目：山東省科技計劃(2013GSF11903);山東省自然科學基金(ZR2015HM080);山東省高校中醫藥抗病毒協同創新課題(XTCX2014C01-03)

作者簡介：林莎莎(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為中藥及天然藥物有效成分及質量控制。Email：786429573@qq.com *通信作者,周洪雷(1967-)，男，教授，博士生導師，研究方向為中藥及天然藥物有效成分及質量控制。Email：zhouhongleitcm@163.com

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)04-0017-04

HPLC based content determination of AstragalosideⅥ and Ⅱ in various probiotics fermented Radix Astragali

LIN Sha-sha1, ZHOU Hong-lei1*, SUN Xiao-lin2,CHI Yu-feng1,JIANG Hai-qiang1, ZHANG Ling1,CHU Xin-hong2

(1. School of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Medical Institute of San Zhu Co., Jinan 250100, China)

Abstract∶We determined content variation of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡ in various probiotics fermented Radix Astragali with HPLC-ELSD. Determination conditions were chromatographic column of Agilent C18 column (250 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase of acetonitrile and water mixture, a linear gradient elution, 1 mL/min flow rate. The contents of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡ in Radix Astragali were 0.476 2 mg/g and 0.050 3 mg/g. After fermentation with mixed probiotics, the contents of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡ were 0.257 8 mg/g and 0.109 4 mg/g.Results show that the content of AstragalosideⅡ increases through probiotics fermentation,but the content of AstragalosideⅥ decreases. Moreover, the contents of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡare different through various probiotics fermentation.

Key words∶Radix Astragali; probiotic fermentation; HPLC-ELSD;AstragalosideⅥ;Astragaloside Ⅱ

【中藥與天然活性產物】