生物技術(shù)應(yīng)用于角蛋白降解的潛力以微生物及其酶改善羽毛與其它角蛋白的營養(yǎng)價(jià)值作為家禽飼料的資源

A.A.Onifade，N.A.Al-Sane， A.A.Al-Musallam，S.Al-Zarban　著張本民　譯

?

生物技術(shù)應(yīng)用于角蛋白降解的潛力以微生物及其酶改善羽毛與其它角蛋白的營養(yǎng)價(jià)值作為家禽飼料的資源

A.A.Onifade，N.A.Al-Sane， A.A.Al-Musallam，S.Al-Zarban著
張本民譯

摘要：生物酶技術(shù)的進(jìn)步，如蛋白溶解酶，有望為家禽羽毛的低能耗生物轉(zhuǎn)化技術(shù)提供幫助。可以將毛從嚴(yán)重的污染物轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)升級(jí)的富含蛋白質(zhì)的家禽飼料。最近，在自然與感染方面提供了最新的生物角蛋白水解信息綱要，強(qiáng)調(diào)生物技術(shù)改善羽毛營養(yǎng)價(jià)值的可能性，同時(shí)也可替換傳統(tǒng)熱解法處理羽毛。有相關(guān)支持證據(jù)證明羽毛生物法處理后其營養(yǎng)價(jià)值提高，氨基酸成份的多樣化，從老鼠和小雞的生長(zhǎng)研究中也獲得了可觀的結(jié)果。參考本文的結(jié)論，建議將羽毛蛋白或其它角蛋白通過生物技術(shù)提高其營養(yǎng)價(jià)值，改變其應(yīng)用途徑，將其作為家禽飼料的來源。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；角蛋白微生物降解；營養(yǎng)改善；家禽羽毛

1　引言

家禽羽毛占家禽體重的5% ～7%，是一種廢棄物，但作為動(dòng)物飼料又具有應(yīng)用的潛力和限制。盡管羽毛對(duì)鳥類來說具有重要作用，但在離開了鳥的身體后，它們的生物學(xué)利用似乎不太理想。家禽羽毛可能組成了自然界中最豐富的角蛋白資源。家禽在被人們食用后，其羽毛就被當(dāng)作廢棄物堆積起來。因此廢棄物就產(chǎn)生了很大的污染影響，尤其隨著全球家禽類產(chǎn)品的增長(zhǎng)。

可以理解，家禽羽毛中大量有潛在使用價(jià)值的蛋白與氨基酸（如表1），可以用作動(dòng)物飼料，這使得羽毛資源循環(huán)利用成為了動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)家感興趣的課題。因?yàn)橛鹈鳛榈鞍罪暳希趦r(jià)格和替代性上都具有潛力。然而，羽毛利用的限制主要是其不容易消化，生物學(xué)價(jià)值低，以及缺乏一些有營養(yǎng)價(jià)值的必須氨基酸，如蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸、色氨酸（Baker et al，1981；Papadopoulos et al，1985；Dalev et al，1997）。同時(shí)，羽毛組成的氨基酸是多變的（Wang and Parsons，1997）。另外，隨著家禽年齡增長(zhǎng)，其毛中總必需氨基酸含量下降，尤其是蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸，而總非必需人氨基酸相對(duì)增加（Stilborn et al，1997）。天然羽毛蛋白的營養(yǎng)缺陷主要來源于維持羽毛蛋白結(jié)構(gòu)剛性的氨基酸組成與分子結(jié)構(gòu)。同樣的原因也可以解釋天然角蛋白不能被大多數(shù)蛋白水解酶降解。蛋白鏈中大量存在的α螺旋（α角蛋白）或β折疊（β角蛋白）形成超螺旋多肽鏈，從而使羽毛具有很強(qiáng)的機(jī)械穩(wěn)定性與抗蛋白酶水解性。大量雙硫鍵的形成也使多肽鏈的交聯(lián)度提高。

表1　處理與未處理羽毛粉中蛋白與氨基酸含量

大量的半胱氨酸促進(jìn)了雙硫鍵的形成。多肽鏈中的氫鍵，疏水作用以及超螺旋的穩(wěn)定性進(jìn)一步促進(jìn)了角蛋白的強(qiáng)度和耐水解性。

然而，生產(chǎn)易消化蛋白粉的傳統(tǒng)方法是熱降解法。根據(jù)Papadopoulus（1989），Latshaw et al.（1994）和Wang and Parsons（1997）可知，熱處理對(duì)營養(yǎng)的改善有限，必需氨基酸像賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸會(huì)遭受損失，并且會(huì)形成非營養(yǎng)氨基酸如溶素丙氨酸、羊毛硫氨酸等（表1）。

在有限的營養(yǎng)改善背景下，考慮到羽毛傳統(tǒng)加工的熱能耗成本，從營養(yǎng)改善，環(huán)境友好和諧，生物資源最優(yōu)化以及成本有效化入手探索一種替代性技術(shù)是合理的。

涉及到微生物及其酶的生物技術(shù)方法是一種概念上合理的處理技術(shù)。然而，還沒有文獻(xiàn)記錄角蛋白水解微生物的工業(yè)應(yīng)用前景，尤其是強(qiáng)調(diào)角蛋白酶產(chǎn)品、性能和其水解的機(jī)理和缺陷的文獻(xiàn)。因此，為了促進(jìn)生物技術(shù)處理羽毛將其用作動(dòng)物飼料，本文綜述了生物法水解角蛋白的最新信息。羽毛營養(yǎng)價(jià)值升級(jí)可以生產(chǎn)出高蛋白飼料，從而可以大大節(jié)約家禽飼料中大豆和魚粉的使用。此外，可以預(yù)測(cè)，羽毛的生物轉(zhuǎn)化會(huì)有益于養(yǎng)禽業(yè)、人類以及環(huán)境。

2　微生物角蛋白水解和角蛋白酶產(chǎn)品

2.1自然界中角蛋白水解的證據(jù)

盡管角蛋白非常穩(wěn)定，但在自然界中羽毛也不會(huì)積累，因此可證明確實(shí)存在天然的角蛋白分解者或食用者。從人類或家禽的蹄、指甲、角質(zhì)層、角、頭發(fā)等角蛋白部分的致病性皮膚真菌和生長(zhǎng)（感染）可以獲得進(jìn)一步證據(jù)，或許會(huì)是自然界中角蛋白降解的一個(gè)更好的研究方面。皮膚真菌一種微生物，可以寄生于活體動(dòng)物的角質(zhì)基層中。當(dāng)此類微生物在含有角蛋白的介質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)，它們可以將角蛋白基質(zhì)作為碳源和氮源而食用。皮膚真菌在角蛋白基質(zhì)中的生長(zhǎng)說明它們有能力合成降解復(fù)雜角蛋白的蛋白水解酶。

2.2微生物角蛋白降解以及它們生物技術(shù)應(yīng)用的理由

很多科研工作者（Yu et al，1969；ElmayergiandSmith，1971；Takiuchi et al，1984；Asahi et al，1985；Wawrzkiewicz et al，1987；Abdel-Hafezand El-Sharoumy，1990；Malviyaet al，1992；Santos et al，1996；SimpanyaandBaxter，1996；Singh，1997）已經(jīng)證明和報(bào)道過很多微生物都能分解角蛋白，這些微生物中大多數(shù)是真菌和細(xì)菌。一些腐生菌和寄生菌可以降解角蛋白（Safranek and Goos，1982）。還有很多新孤立的微生物表現(xiàn)出降解角蛋白的性能。最近，Lin et al.（1995）測(cè)序并表達(dá)了ker A基因，它能翻譯出地衣芽孢桿菌PWD-1 97%序列一致的角蛋白水解酶。

觀察角蛋白底物的天然降解與寄生蟲感染降解，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，作為動(dòng)物飼料通生物技術(shù)提高羽毛利用是可靠的。這與Lin，Dozie和Santos等人的斷言一致。

生物技術(shù)在羽毛加工上的應(yīng)用具有以下重要意義。第一，微生物的培養(yǎng)和角蛋白酶的活力可能會(huì)改變羽毛角蛋白的結(jié)構(gòu)。這就有可能改變對(duì)食用動(dòng)物消化酶的抵抗性（Elmayergi and Smith，1971；Barabas，G.等，未公開結(jié)果，1986；Benedek等，1985；Willianms and shih，1989）。此外，可以有從微生物蛋白質(zhì)的生物量的羽毛粉，可能是互補(bǔ)或添加劑的營養(yǎng)富集。Barabas，G等（未公開發(fā)表結(jié)果，1986）發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)酵羽毛相比，發(fā)酵羽毛中賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高，得出結(jié)論，不僅羽毛角蛋白可以作為蛋白來源，微生物也可以。Earlier，Elmayergi和 Smith（1997）已經(jīng)報(bào)道過，通過S.fradiae的一種蛋氨酸分泌突變體發(fā)酵的羽毛蛋氨酸和賴氨酸含量有少量增加。第三，氨基酸的生產(chǎn)也是可行的，尤其是飼料級(jí)的賴氨酸和其它來自于羽毛微生物發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸（MohammedEl-Akied，1987；Williams和Shih，1989）。表2和表3提供了發(fā)酵羽毛營養(yǎng)改善（氨基酸含量增加）的證據(jù)。

2.3角蛋白降解微生物的生態(tài)學(xué)

角蛋白降解微生物在自然界普遍存在，盡管傾向于靠角蛋白基物生長(zhǎng)。或許研究最透徹的就是皮膚癬菌因?yàn)榇蠖鄶?shù)研究者對(duì)病理學(xué)很感興趣（Grappel和Blank，1972；Higuchi等，1981；Wawrzkiewicz等，1987，1991；Apodaca和Mckerrow，1989；Hanel等，1991；Porro等，1997）。Geophilllic皮膚寄生真菌得到了很大關(guān)注（Abdul-Fatah等，1982；Al-Musallam，1988；）。角蛋白降解微生物已經(jīng)從污泥中分離（Ulfig和Korcz，1983，1994）。一種嗜動(dòng)物性皮膚真菌發(fā)癬菌對(duì)雞毛有高度專一性（Wawrzkiewi cz等，1987）。

具有角蛋白降解能力的非寄生真菌也被分離來對(duì)它們的酶進(jìn)行提純和角蛋白水解性評(píng)估（Malciya等，1992，1993a，b；Dozie等 ，1994）。 Williams和Shih從混合了糞便與雞毛的消化池中分離了B型地衣桿菌。從土坑壤中分離了鏈霉菌sp.A11，可產(chǎn)生解朊和角蛋白水解活性（Mukhopadhyay和Chandra，1990）。Santos等人1996年報(bào)道了煙曲霉菌，這是一種在人體，鳥類和其它動(dòng)物中普遍存在并伺機(jī)靠空氣傳播的病原體，將雞毛作為其唯一的碳和氮源。

表2　微生物處理與未處理樣品的氨基酸組成

表3　發(fā)酵與未發(fā)酵羽毛粉中挑選氨基酸濃度

角蛋白降解微生物在不同生態(tài)和環(huán)境條件下生長(zhǎng)，并且溶解角蛋白基物和其它復(fù)合蛋白基物的能加很寬泛。微生物主要是通過合成和分泌蛋白酶將底物降解和分解為可吸收的小分子營養(yǎng)素。然而，有相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了具有角蛋白水解活性的蛋白內(nèi)切酶或細(xì)胞結(jié)合酶（Yu等，1971；Lamkin等，1996）。同時(shí)對(duì)于它們?cè)趶?fù)合蛋白底物中的分子機(jī)理的理解仍遠(yuǎn)不夠。

2.4角蛋白降解酶的特性

通過能夠降解角蛋白的微生物在細(xì)胞內(nèi)或外加工釋放出的特性蛋白酶命名為角蛋白酶或角蛋白水解酶。這種酶與其它類似的蛋白水解酶相比，水解復(fù)合底物的活性更好，從而就區(qū)分了角蛋白酶與其它蛋白酶或肽酶。

多數(shù)角蛋白酶在很大程度上是誘導(dǎo)性的，需要角蛋白作為外源誘導(dǎo)物。某些微生物的角蛋白酶有消抑制作用，如念珠菌、白色念珠菌 （Kapica和 Blank，1957，1958和金孢子菌（DOZIE等，1994）分化帶來他們從組成前分泌表達(dá)的細(xì)胞結(jié)合的角蛋白酶。

許多角蛋白酶在細(xì)胞外是有活性的，從合成物的細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)釋放出。然而，與細(xì)胞相關(guān)活力的證據(jù)蛋白酶已有報(bào)道癬菌（Yu等，1971），和一種被充分研究過的角蛋白降解微生物毛癬菌（Lamkin等，1996）。但T.rubrum的內(nèi)切酶對(duì)蛋白質(zhì)底物具有寬的選擇范圍，不像T.gallinae。

本文獻(xiàn)描述了不同微生物對(duì)角蛋白的水解活力和酶底物的專一性。這可能是方法論和物種不同的原因。例如，Lin等1992年發(fā)現(xiàn)從B.地衣桿菌中提取的蛋白酶可以水解所有被測(cè)的蛋白底物，包括牛血清蛋白、膠原、彈性蛋白和羽毛角蛋白。與上述一致，Bockle等1995年觀察了從雞毛不同可溶底物（酪蛋白與明膠）與不可溶底物（天然與熱壓處理）所含肽的釋放情況。相反，Dozie等1994年報(bào)道了一種親熱性角蛋白水解酶。這種酶從C.keratinophllum中獲得，只水解角蛋白，但對(duì)酪素、牛血清蛋白或角蛋白粉無水解活力。這表明分離的酶對(duì)角蛋白底物具有專一性。從另一個(gè)角度，Bockle 等1995年發(fā)現(xiàn)，在40～70℃范圍內(nèi)用角蛋白降解S.pactum的培養(yǎng)濾液可以將完整雞毛分解，遠(yuǎn)超過了生理需求，然而，純化酶的溶解率還不到底物的10%。

高度專一性細(xì)胞內(nèi)角蛋白酶通 過T.gallinae加 工 釋 放（Wawrzkiewicz等，1987）。從一些角蛋白降解微生物中提取的特征角蛋白酶的物理化學(xué)性能總結(jié)在表4中。

2.5微生物角蛋白水解的機(jī)理

角蛋白微生物水解的基本是一種蛋白降解的過程，因?yàn)榈孜铮ń堑鞍祝┍举|(zhì)上就是蛋白質(zhì)，也就說蛋白重量占95%。盡管角蛋白酶的物理化學(xué)性能不同，但它們對(duì)角蛋白具有相同作用這一點(diǎn)毋庸置疑。大多數(shù)角蛋白水解酶特性可以作為蛋白酶，對(duì)角蛋白有活性。然而，對(duì)于角蛋白水解的重要機(jī)理和角蛋白降解微生物的新陳代謝還不太清楚。盡管對(duì)角蛋白酶的動(dòng)力行為缺乏完整理解，但很多證據(jù)證明以下流程存在的可能性。

2.6機(jī)械的角蛋白水解

這只用于真菌和菌絲體的生產(chǎn)，角蛋白降解微生物。機(jī)械角蛋白水解可以理解為是由角蛋白底物或菌絲壓力引起的角蛋白降解。Malviya等1992注意到，在細(xì)胞外發(fā)現(xiàn)角蛋白酶活性之前角蛋白就開始水解了，而且降解與菌絲體生長(zhǎng)有關(guān)。這或多或少預(yù)示了機(jī)械降解。真菌菌絲體生長(zhǎng)與伸長(zhǎng)對(duì)復(fù)合底物產(chǎn)生壓力或作為完整的角蛋白水解機(jī)理，機(jī)械降解的證據(jù)已被預(yù)先討 論 過 （Wawrzkiewicz等1987）。

表4　從一些角蛋白降解微生物中提取的角蛋白酶的性能

真菌對(duì)宿主的入侵結(jié)合了機(jī)械壓力與酶的水解。通過Figueras等最近的研究，在不考慮成分結(jié)構(gòu)角質(zhì)化的前提下，使用超微結(jié)構(gòu)顯微照片可以觀察出真菌垂直侵蝕毛發(fā)的能力。菌絲的機(jī)械滲透是有必要的，有利于暴露出更多酶解肽鍵的反應(yīng)位點(diǎn)。

從可獲得的證據(jù)來看，或許可假設(shè)機(jī)械角蛋白降解促進(jìn)了酶的水解，實(shí)際上當(dāng)菌絲產(chǎn)生外切蛋白酶時(shí)更是這樣。機(jī)械水解和酶水解和協(xié)同作用或許發(fā)生在起始過程之后。然而，純化角蛋白酶的初始化能力，持續(xù)羽毛降解的能力也許會(huì)對(duì)以上假設(shè)產(chǎn)生質(zhì)疑。

2.7硫解

因?yàn)橛鹈壑邪腚装彼岷枯^高，才出現(xiàn)了硫解的標(biāo)志。可以理解，羽毛中含有半胱氨酸的優(yōu)勢(shì)就是通過形成雙硫健使生物分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。大從數(shù)研究工作者已經(jīng)認(rèn)為角蛋白降解的一種可能機(jī)理就是雙硫鍵的斷裂。然而，驗(yàn)證性研究在這方面很缺乏。

2.7.1硫解證據(jù)

在角蛋白的降解過程中，Kunert的調(diào)查對(duì)硫解提供了深刻的理解。從 Ruffin等和Malviya等的研究中也獲得了貢獻(xiàn)性證據(jù)。雙硫鍵是角蛋白具有突出穩(wěn)定性與抗降解性的主要原因。只有通過雙硫鍵斷裂使蛋白變性，角蛋白才可以完全水解，大家對(duì)此達(dá)成共識(shí)。

根據(jù)Kunert（1992），癬菌和非癬菌將代謝出的自由的或結(jié)合的半胱氨酸作為硫源和氮源（Ziegler等1969）。通過真菌代謝的胱氨酸產(chǎn)物是無機(jī)硫和其它中間產(chǎn)物。Kunert（1992）認(rèn)為過量的硫以氧化態(tài)的硫酸鹽和亞硫酸鹽形式排泄回介質(zhì)中。根據(jù)下面反應(yīng)式，在中性至堿性pH范圍內(nèi)，亞硫酸鹽與胱氨酸反應(yīng)，生成半胱氨酸和硫磺基半胱氨酸。

根據(jù)Kunert（1992），結(jié)合在蛋白質(zhì)上的胱氨酸也會(huì)發(fā)生這種反應(yīng)，包括角蛋白。因此由于亞硫酸鹽的釋放，角蛋白在被蛋白酶降解之前就已經(jīng)變性了，這就導(dǎo)致了雙硫鍵的分解。Kunert，Malviya等人提供了雙硫鍵斷裂與角蛋白分解同時(shí)進(jìn)行的充實(shí)證據(jù)。實(shí)事上，Malviya等人發(fā)現(xiàn)只有超過一半的角蛋白被降解后才能在培養(yǎng)介質(zhì)中檢測(cè)到角蛋白。這也就意味著角蛋白有非酶或非水解方式的降解。在角蛋白培養(yǎng)液中出現(xiàn)像磺化半胱氨酸，硫代硫酸鹽，硫酸鹽以及半胱氨酸這樣的硫解產(chǎn)物進(jìn)一步證明雙硫鍵斷裂。然而，很多研究者幾乎未檢測(cè)到中間產(chǎn)物。對(duì)于這種現(xiàn)象的解釋是真菌優(yōu)先將半胱氨酸作為硫源。Malviya 與Mohammed El-Akied的研究表明培養(yǎng)液中殘留半胱氨酸量持續(xù)下降，很明顯是因?yàn)楸徽婢x消耗。

此外，當(dāng)加入DDT，DMSO，巰基乙醇鹽，蘇糖醇等還原劑時(shí)可以加強(qiáng)角蛋白水解，這就可以提供物理化學(xué)的證據(jù)。為了確認(rèn)亞硫酸鹽分泌降解角蛋白先于真菌蛋白酶降解角蛋白，Kunert比較了五種還原劑磺酸鈉、半胱氨酸、谷氨酰胺、巰基乙醇和蘇糖醇對(duì)微孢菌蛋白酶活性的影響效果。結(jié)果表明，亞硫酸鈉在濃度為3.78 mg/mL時(shí)，蛋白酶活性提高最多，達(dá)到2.9倍。半胱氨酸，巰基乙醇，谷氨酰胺的效果逐步下降，并且濃度在0.3～1.0 mmol時(shí)效果最好。效果最差的是蘇糖醇。Kunert發(fā)現(xiàn)，24 h內(nèi)，胱氨酸橋鍵斷裂32%、66%和97%并且轉(zhuǎn)化為硫磺基半胱氨酸后，水解效果分別增加3.7、29和43倍。Kunert討論了獲得的結(jié)果，從而揭示出隨著硫解程度增加，蛋白水解的敏感性迅速增加并且底物的溶解也可以從微觀證明和重量測(cè)定。Bockle等人也證明了添加DDT對(duì)細(xì)菌蛋白酶混合物和純角蛋白酶的角蛋白水解活性有催化效果。作者還發(fā)現(xiàn)如果沒有1% 的DDT加入，角蛋白降解率只有大約10%，然而加入后能夠達(dá)到70%。此前，Takami等人發(fā)現(xiàn)巰基乙酸鹽催化時(shí)，pH12，溫度70℃，1 h內(nèi)就可將毛完全溶解。并且，在無還原劑的情況下，蛋白酶幾乎無角蛋白水解活性。Sinha等人還報(bào)道了S.fradiae的兩種絲氨酸蛋白酶，在加入DDT后蛋白酶活性增強(qiáng)。加入巰基乙酸鹽時(shí)，S.pactum的蛋白酶無活性，但加入DDT后有活性。這就表明，微生物酶對(duì)能還原雙硫鍵的化學(xué)試劑具有不同反應(yīng)。

其它驗(yàn)證性間接數(shù)據(jù)也有，兩種非專一性蛋白酶胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶硫解天然羊毛相同的降解效果，這可以作為驗(yàn)證性的間接數(shù)據(jù)。Everett之前也報(bào)道了一種類似的發(fā)現(xiàn)。組織化學(xué)反應(yīng)也揭示出在硬角蛋白降解的位點(diǎn)上有大量硫磺基團(tuán)。然而，不同微生物的硫解能力不同，這或許與它們寄生潛能的差別相關(guān)。

2.8蛋白水解

然而，角蛋白的水解階段或許被過度簡(jiǎn)化了，并且與肽鍵水解類似，角蛋白酶的敏感性不同。不同的相對(duì)分子質(zhì)量、活化劑以及最適環(huán)境條件（pH，溫度）表明仍缺乏酶解蛋白機(jī)理的相關(guān)知識(shí)。的確，非專一蛋白酶降解硫化角蛋白的能力使角蛋白酶的專一性進(jìn)一步復(fù)雜化。這種矛盾在纖維素、甲殼素、多糖這類復(fù)雜有機(jī)化合物的微生物代謝中普遍存在。

但是，與其它蛋白酶相比時(shí)，微生物角蛋白酶的高水解性是一個(gè)突出的因素。此外，純角蛋白對(duì)長(zhǎng)鏈和復(fù)雜分子的特殊偏愛也對(duì)支持角蛋白專一性提供了補(bǔ)充證據(jù)。角蛋白酶對(duì)底物的專一性也暗示了不同作用方式的可能，但仍然有待了解。

2.9角蛋白水解的反應(yīng)順序

對(duì)角蛋白降解提出精確的反應(yīng)順序是有困難的。然而，對(duì)于真菌和放線菌，大概從菌絲的生長(zhǎng)開始，接著分泌破壞雙硫鍵亞硫酸鹽，最后蛋白水解。過了初始階段，幾個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行，微生物也仍在生長(zhǎng)。當(dāng)有細(xì)菌體、純酶或粗酶加入時(shí)，或許是一種不同的降解機(jī)理。這基本上需要角蛋白底物的分解。Kunert經(jīng)過大量研究證實(shí)了真菌存在時(shí)角蛋白降解的假設(shè)路徑，當(dāng)使用純酶時(shí)，角蛋白酶分離純化后的結(jié)果可以從表面上說明可能的機(jī)理。也很可能是一種單獨(dú)的作用模式，或許不會(huì)適用于所有類型的角蛋白降解微生物。

2.10羽毛粉的微生物處理：生物技術(shù)應(yīng)用的可能性

大多數(shù)研究者同意作為飼料蛋白羽毛（角蛋白）的微生物轉(zhuǎn)換代表了一種改善羽毛使用價(jià)值微生物技術(shù)。通過在羽毛中培養(yǎng)角蛋白降解微生物，接著在細(xì)胞外分泌角蛋白酶，可以達(dá)到羽毛的生物降解。不用微生物單獨(dú)使用含有角蛋白酶或粗酶的培養(yǎng)濾液，或著單獨(dú)使用純酶也可達(dá)到羽毛的生物降解。

2.11羽毛粉營養(yǎng)改善的證據(jù)

Elmayergi和 Smith的研究為我們作了先驅(qū)工作，他們?cè)u(píng)價(jià)了S.fradiae發(fā)酵后羽毛粉的氨基酸的營養(yǎng)補(bǔ)充情況。盡管發(fā)酵產(chǎn)品的蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸含量仍很低，但與未發(fā)酵產(chǎn)品相比，蛋氨酸含量增加（表3）。Elmayergi和Smith表示羽毛發(fā)酵后所有氨基酸的濃度均大大提高。然而，通過喂養(yǎng)試驗(yàn)得出的結(jié)果表明發(fā)酵與未發(fā)酵羽毛粉的營養(yǎng)價(jià)值無太大區(qū)別（表5）。這也就解釋了產(chǎn)品不能用于雞類的原因。通過補(bǔ)充蛋氨酸以達(dá)到生物需求繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，即給肉雞喂食分離的大豆，最終肉雞的生長(zhǎng)率發(fā)生了明顯的變化。在一個(gè)類似的研究中，Barabas，G等人發(fā)現(xiàn)與完整羽毛相比微生物發(fā)酵的羽毛粉中賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高（表2）。作者分析了兩組老鼠喂養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)喂食羽毛水解物的老鼠體重未減少，而喂食少蛋白食物的老鼠體重減少。盡管喂食羽毛粉的老鼠可能因?yàn)榈鞍彼崛狈Χ畜w重下降的可能，但這些研究也可確認(rèn)羽毛水解物的可消化性和使用性。從他們的研究中可以得出結(jié)論，不僅羽毛粉（角蛋白）可以當(dāng)作蛋白質(zhì)喂食動(dòng)物，同時(shí)產(chǎn)酶菌的生物量也可以。

2.12粗角蛋白酶的使用

Lee等人報(bào)道了粗角蛋白酶作為飼料添加劑首次使用。角蛋白酶從地衣芽孢桿菌中獲得。他們發(fā)現(xiàn)，添加了角蛋白酶后原毛總氨基酸的可消化性從30%增加到66%，而商品毛從77%增加到了99%。在第二個(gè)以8天為基準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)年齡三周大肉雞分別喂食大豆粉、商業(yè)羽毛粉、角蛋白酶補(bǔ)充處理的羽毛粉，肉雞的日增長(zhǎng)量分別為66 g，50 g，56 g。從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論，添加角蛋白酶可以提高羽毛產(chǎn)品的可消化性，這樣就擴(kuò)大了角蛋白酶在增強(qiáng)羽毛粉營養(yǎng)方面的應(yīng)用。

2.13純角蛋白酶的使用

萊納大學(xué)J.C.H Shih和他的同事獲得了純角蛋白酶作為飼料補(bǔ)充的大量應(yīng)用證據(jù)。為了降低酶的自分解，研究者最近所作的努力是將從地衣桿菌分離的純角蛋白酶固化。固化角蛋白酶對(duì)不可溶的羽毛角蛋白和可溶性的酪素都表現(xiàn)出水解活性。而且與未固化角蛋白酶相比表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性和耐酸性，因此增加了其在更多應(yīng)用上使用的潛能。

2.14生物技術(shù)方法對(duì)羽毛營養(yǎng)改善的建議途徑

考慮到生物技術(shù)應(yīng)用于羽毛營養(yǎng)改善具有很大潛能，在羽毛加工上，微生物技術(shù)的應(yīng)用范圍如下：

（1）獲得完全的羽毛結(jié)構(gòu)降解。通過化學(xué)處理或微生物處理或幾種方法結(jié)合處理達(dá)到硫解是可行的。需要全面實(shí)施對(duì)外部?jī)?nèi)部以及培養(yǎng)過程中輔因子的研究，因?yàn)檫@些輔因子或許會(huì)優(yōu)化酶的催化作用。

（2）加強(qiáng)羽毛粉的營養(yǎng)價(jià)值，尤其是蛋氨酸和賴氨酸的含量。可能以下任何生物技術(shù)工具的結(jié)合都是相關(guān)的。

1）像賴氨酸這種主要有限氨基酸的轉(zhuǎn)肽作用或氨基酸結(jié)合或共價(jià)結(jié)合作用。

表5　喂食未發(fā)酵與發(fā)酵羽毛粉生長(zhǎng)小雞的影響

2）通過角蛋白降解微生物的突變或蛋白質(zhì)工程進(jìn)行基因操控。

3）角蛋白酶基因在無害微生物的翻譯，因?yàn)楹芏嗷钚越堑鞍姿馕⑸锞哂兄虏⌒浴?/p>

（3）使用一種聯(lián)合方法設(shè)計(jì)出一種微生物復(fù)合酶很有意義，這種方法能將角蛋白水解酶與肽解酶進(jìn)行共同加工。也需要考慮結(jié)合能分有限氨基酸（蛋氨酸和賴氨酸）的細(xì)菌作為聯(lián)合成員的可能性。從混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了很多這種微生物協(xié)同作用的例子，如在動(dòng)物飼料中添加益生茵，又如微生物纖維素酶復(fù)合物用作飼料添加劑。能產(chǎn)生多組分酶復(fù)合物的真菌將會(huì)是理想的考慮對(duì)象。

（4）使微生物在高溫下獲得穩(wěn)定性是生物技術(shù)應(yīng)用的先決條件，并且在中性條件下具有活性也是有益的。或許在較高的培養(yǎng)溫度下并且通過使用具有還原性的添加劑（化學(xué)試劑）可以獲得較高的角蛋白水解率。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道說，酶中一些二價(jià)金屬的穩(wěn)定效應(yīng)導(dǎo)致了它們的高活性。

（5）進(jìn)一步為角蛋白酶產(chǎn)品篩選具有極高活性的非致病微生物，以及酶在無需分離和純化條件下的使用。它們的生物量可能對(duì)最終產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和氨基酸含量有貢獻(xiàn)。

（6）通過對(duì)皮膚桿菌致病機(jī)理知識(shí)的整理綜合深刻了解了角蛋白結(jié)構(gòu)降解的機(jī)理。這種合作性研究將會(huì)對(duì)家禽羽毛的營養(yǎng)優(yōu)化產(chǎn)生有效的生物技術(shù)策略。

3　結(jié)論

對(duì)家畜來說，家禽羽毛和其它角蛋白是具有潛在價(jià)值的蛋白飼料資源，由于鳥類羽毛的結(jié)構(gòu)功能使其缺乏必需氨基酸，并且消化性不好。天然角蛋白降解微生物的存在使微生物酶技術(shù)成為可能。相比傳統(tǒng)熱降解處理方法，微生物酶技術(shù)可以得到營養(yǎng)更平衡，消化性更好的產(chǎn)品。此外，微生物酶技術(shù)更低能更環(huán)保。

參考文獻(xiàn)略。

致謝：非常感謝Mr Y.A.Fasasi提供研究上的幫助。