紫外誘變篩選柄籃狀菌尿嘧啶缺陷型菌株

周志義，張佑紅，耿安麗

(武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430073)

?

紫外誘變篩選柄籃狀菌尿嘧啶缺陷型菌株

周志義，張佑紅，耿安麗

(武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430073)

摘要：柄籃狀菌EMM是一株從原始菌OPC4誘變獲得的高產纖維素酶菌株。為了獲得轉化用的宿主菌，通過紫外誘變的方法，在1.5 g·mL-15-FOA的篩選壓力下，從EMM誘變得到一株尿嘧啶營養缺陷型菌株EMU6。從原始菌OPC4的基因組里克隆出2 553 bp的pyrF基因，NCBI比對發現，pyrF為編碼乳清酸磷酸核糖基轉移酶的基因，影響尿嘧啶的合成。測序比對發現，尿嘧啶營養缺陷型菌株EMU6的pyrF基因在1 160 bp處有一個核苷酸缺失。柄籃狀菌尿嘧啶營養缺陷型菌株的獲得使基于pyrF基因轉化體系的建立成為可能。

關鍵詞：柄籃狀菌；尿嘧啶營養缺陷型；PEG/CaCl2轉化法；pyrF；紫外誘變

木質纖維素是世界上最豐富的生物能源材料，大量的糖類以纖維素和半纖維素的形式存在其中，因而成為生物乙醇生產最有潛力的來源[1-2]。相較于其它生物能源材料，木質纖維素生產生物乙醇的最大優勢是不會消耗糧食[3]。木質纖維素生產生物乙醇的第一步是將其水解成單糖，常用的方法有2種：化學處理和酶處理。化學處理所用的試劑會污染環境且處理不充分，酶處理則不需使用其它化學試劑而且環保[4-5]。水解木質纖維素的酶主要有纖維素酶和半纖維素酶，這兩種酶的高成本制約著酶處理在工業上的廣泛應用[6]。

本課題組從自然界中分離出柄籃狀菌OPC4，經多次誘變得到纖維素酶高產菌EMM，優化了其發酵條件。為進一步提高其產酶量，欲利用基因工程過量表達EMM纖維素酶和半纖維素酶。為了能將待表達的基因順利導入EMM，首先要建立一個適合柄籃狀菌的轉化體系。真菌的轉化方法一般有3種：PEG/CaCl2轉化法、農桿菌轉化法、電轉化法[7]。由于農桿菌轉化法過于復雜，電轉化法條件不好摸索[8]，而從柄籃狀菌菌絲制備原生質體[9]比較簡單而且量大，故選擇PEG/CaCl2轉化法。標記基因主要有3類：藥物抗性標記基因、營養缺陷型標記基因及功能標記基因[10-11]。由于要轉化多個基因，需建立一個可以重復使用的標記基因，營養缺陷型標記基因pyrF可重復使用且操作方法簡單成熟。pyrF為編碼乳清酸磷酸核糖基轉移酶的基因，影響尿嘧啶的合成，可用5-氟乳清酸(5-FOA)篩選[12]。

作者以紫外誘變篩選得到的一株尿嘧啶營養缺陷型菌株作為宿主菌，在克隆出柄籃狀菌pyrF基因的基礎上，建立了以pyrF為標記基因的轉化體系，為后續外源基因的導入打下基礎。

1實驗

1.1材料

1.1.1質粒與菌種

用于轉化的載體pGEF2自行構建，以pGEM-T為骨架，引入pyrF片段。大腸桿菌(E.coli)DH5α、原始菌柄籃狀菌OPC4及其誘變菌株EMM，自行保存。

1.1.2酶與試劑

DNA聚合酶、T4連接酶、phusion高保真酶，Thermo Scientific公司；pGEM-Teasy Vector，Promega公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，Omega Bio-Tek公司。

尿嘧啶核苷(Uracil)、氨芐青霉素(Amp)、5-氟乳清酸(5-FOA)、裂解酶，Sigma公司；引物由Sigma公司合成。

1.1.3培養基

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)進行原始菌柄籃狀菌菌絲的培養。基礎培養基配方如下：NH4Cl 1.4 g·L-1，KCl 1.4 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，MgSO40.3 g·L-1，葡萄糖15 g·L-1，微量元素1 mL·L-1，5-FOA 1.5 g·L-1，尿嘧啶2 g·L-1。

1.2方法

1.2.190%致死率紫外線照射時間的選擇

從PDA平板取新鮮的EMM孢子，用10 g·L-1NaCl溶液將孢子濃度調至1×104個·mL-1，取5 mL置于無菌平皿內，平放在40 W紫外燈管下35 cm處，分別照射0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s后取200 μL涂布在基礎培養基平板上，30 ℃培養3 d，統計平板上的菌落數，計算存活率，確定90%致死率的紫外線照射時間[13]。

1.2.25-FOA最小抑制濃度的選擇

將新鮮培養的EMM孢子濃度調至1×104個·mL-1，取200 μL分別涂布在含有不同濃度5-FOA的基礎培養基上，30 ℃培養3 d，觀察各平板上EMM的生長情況，確定5-FOA對EMM的最小抑制濃度。

1.2.3尿嘧啶營養缺陷型菌株的篩選

將新鮮培養的EMM孢子濃度調至1×106個·mL-1，在紫外線照射90%致死率的時間后，取200 μL涂布在含有尿嘧啶和5-FOA的基礎培養基平板上，30 ℃培養3 d。挑選單菌落分別接種到含與不含尿嘧啶的基礎培養基平板上，對比生長狀態，篩選出EMM尿嘧啶營養缺陷型菌株。

1.2.4原始菌OPC4 pyrF基因的克隆

采用玻璃珠振蕩破壁法[14]從OPC4菌絲體中提取基因組DNA，并根據柄籃狀菌基因組設計引物將pyrF克隆出來，pyrF上游引物pyrF1：5′-GGTCTAGAGGATCCTGTCACAGTGTCGGTACTG-3′，下游引物pyrF2：5′-GGGAATTCCATGCATGTTGAT-AGGTCGGTCAAT-3′。獲得長度為2.6 kb的DNA片段，目的條帶膠回收后加A連接到pGEM-Teasy Vector上，大腸桿菌轉化后獲得陽性克隆，搖菌過夜，提取質粒pGEF2后送Sigma公司測序。

1.2.5pyrF基因突變株的篩選

用phusion高保真酶以pyrF上下游引物pyrF1和pyrF2擴增出尿嘧啶營養缺陷型菌株的pyrF基因，將其送Sigma公司測序，用DNASTAR軟件進行比對，確定突變位點。

2結果與討論

2.190%致死率紫外線照射時間的確定

為了確定最適紫外誘變時間，對EMM紫外線照射不同時間，得到的存活率曲線見圖1。

圖1　EMM的存活率曲線Fig.1　Survival curve of strain EMM

由圖1 可知，90 s為EMM的90%致死率紫外線照射時間。

2.25-FOA 最小抑制濃度的確定

觀察EMM在不同濃度5-FOA平板上的生長情況，結果見表1。

表15-FOA對EMM的抑制作用

Tab.1　Inhibition effect of 5-FOA on strain EMM

注：“++”表示生長正常，“+”表示生長微弱，“-”表示不能生長。

由表1可知，隨著5-FOA濃度的增大，菌株EMM的生長減慢，當5-FOA濃度為1.5 g·L-1時，EMM已不能生長。故確定1.5 g·L-1為5-FOA對EMM的最小抑制濃度。

2.3尿嘧啶營養缺陷型菌株的篩選

EMM可以在不含尿嘧啶的平板上生長，但不能在含5-FOA的平板上生長；尿嘧啶營養缺陷型菌株不能在不含尿嘧啶的平板上生長，但可以在含5-FOA與尿嘧啶的平板上生長，這可以作為篩選尿嘧啶營養缺陷型菌株的依據。經紫外誘變后得到6株能在含5-FOA與尿嘧啶平板上生長的菌株，分別命名為EMU1～EMU6，然后將它們分別涂布在含尿嘧啶和不含尿嘧啶的平板上。結果發現，EMU1～EMU6均能在含尿嘧啶的平板上生長，但只有EMU6不能在不含尿嘧啶的平板上生長(圖2)。由此可以基本證明EMU6為尿嘧啶營養缺陷型菌株。

圖2　尿嘧啶營養缺陷型菌株的篩選Fig.2　Isolation of uracil auxotrophic strain

2.4原始菌基因組 DNA 的提取

利用pyrF引物從OPC4基因組中克隆出一條2.6 kb的片段，測序結果的BLAST比對顯示，該片斷與Talaromycescellulolyticus(Y-94)編碼乳清酸磷酸核糖基轉移酶的pyrF基因(AB668056.1)同源性高達97%。將這2個基因分別翻譯成氨基酸序列后進行比對，發現有6個氨基酸存在差異(圖3)。

圖3　EMM與Y-94乳清酸磷酸核糖基轉移酶推導氨基酸序列的比對結果Fig.3　Comparison of the deduced amino acid sequence of the OPRTase from EMM and Y-94

2.5pyrF基因突變株的篩選

EMM和尿嘧啶營養缺陷型菌株EMU6的pyrF基因測序結果見圖4。

由圖4可知，與原始菌OPC4的pyrF基因比對發現，EMU6的pyrF基因在1 160 bp處發生了核苷酸缺失，造成乳清酸磷酸核糖基轉移酶的失活。pyrF基因在1 160 bp處發生核苷酸缺失導致EMU6不能產生乳清酸磷酸核糖基轉移酶。乳清酸磷酸核糖基轉移酶是尿嘧啶合成中的關鍵酶，它的缺失使EMU6不能在沒有尿嘧啶的培養基上生長。

圖4EMU6與EMMpyrF基因的部分序列比對結果

Fig.4Partial sequence comparison ofpyrFgene from EMU6 and EMM

3結論

通過紫外誘變的方法從柄籃狀菌EMM誘變得到了一株尿嘧啶營養缺陷型菌株EMU6，對EMU6的pyrF基因測序，測序結果與原始菌OPC4的pyrF基因比對發現，EMU6的pyrF基因在1 160 bp處發生了核苷酸缺失，造成乳清酸磷酸核糖基轉移酶的失活。

柄籃狀菌尿嘧啶缺陷型菌株的成功獲得，使得后續在分子上的基因表達調控和蛋白分泌研究成為可能。pyrF作為一種營養缺陷型標記基因，可以將其構建成可循環使用的標記基因表達盒，這將為后續多基因的表達和調控提供便利，對真菌的研究具有重要價值。

參考文獻：

[1]LEVIN D B,PITT L,LOVE M.Biohydrogen production,prospects and limitations to practical application[J].International Jounral of Hydrogen Energy,2004,29(2):173-185.

[2]LEVIN D B,SPARLING R,ISLAM R,et al.Hydrogen production byClostridiumthermocellum27405 from cellulosic biomass substrates[J].International Journal of Hydrogen Energy,2006,31(11):1496-1503.

[3]LYND L R.Overview and evaluation of fuel ethanol from lignocellulosic biomass:technology,economics,the environment,and policy[J].Annu Rev Energy Environ,1996,21:403-465.

[4]HIDENO A,INOUE H,TSUKAHARA K,et al.Wet disk milling pretreatment without sulfuric acid for enzymatic hydrolysis of rice straw[J].Bioresour Technol,2009,100:2706-2711.

[5]ENOCH Y P,KAZUYA N,TATSUYA K.Improvement of cellulase production in cultures ofAcremoniumcellulolyticususing pretreated waste milk pack with cellulase targeting for biorefinery[J].Bioresource Technology,2011,102:6120-6127.

[6]CARERE C R,SPARLING R,CICEK N,et al.Third generation biofuelsviadirect cellulose fermentation[J].International Journal of Molecular Sciences,2008,9(7):1342-1360.

[7]OLMEDO-MONFIL V,CORTES-PENAGOS C,HERRERAE-STRELLA A.Three decades of fungal transformation key concepts and applications[J].Methods Mol Biol,2004,267:297-313.

[9]FU G，XU Y，LI Y，et al.Construction of a replacement vector to disruptpksCTgene for the mycotoxin citrinin biosynthesis inMonascusaurantiacusand maintain food red pigment production[J].Asia Pac J Clin Nutr,2007,16:137-142．

[10]RUIZ-DIEZ B.Strategies for the transformation of filamentous fungi[J].J Appl Microbiol,2002,92:189-195.

[11]CAMPOY S,PREZ F,MARTIN J F,et al.Stable transformation of the azaphilone pigment-producingMonascuspurpureusobtained by protoplast transformation and Agrobacterium-mediated DNA transfer[J].Curr Genet,2003,43:447-452.

[12]FUJII T,IWATA K,MURAKAMI K,et al.Isolation of uracil auxotrophs of the fungusAcremoniumcellulolyticusand the development of a transformation system with thepyrFgene [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2012,43:245-249.

[13]MATTERN I E,van NOORT J M,van den BERG P,et al.Isolation and characterization of mutants ofAspergillusnigerdeficient in extracellular proteases[J].Molecular and General Genetics,1992,234(2):332-336.

[14]YU J H,HAMARI Z,HAN K H,et al.Double-joint PCR:a PCR-based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi[J].Fungal Genetics and Biology,2004,41:973-981.

[15]HASHIMOTO S,OGURA M,ARITOMI K,et al.Isolation of auxotrophic mutants of diploid industrial yeast strains after UV mutagenesis[J].Appl Environ Microbiol,2005,71:312-319.

基金項目：新加坡國立研究基金會項目(NRF20100TH-TRD001-003)

收稿日期：2016-03-25

作者簡介：周志義(1992-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：制藥工程，E-mail：zhouzhiyi1992@gmail.com；通訊作者：張佑紅，教授，E-mail：youhong@aliyun.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.011

中圖分類號：TQ 351.011

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)07-0048-04

Isolation ofTalaromycesstipitatusUracil Auxotrophic Strain by UV Mutagenesis

ZHOU Zhi-yi，ZHANG You-hong，GENG An-li

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstituteofTechnology,Wuhan430073,China)

Abstract：Talaromyces stipitatus EMM is a high cellulase-producing strain that mutated from Talaromyces stipitatus OPC4.In order to prepare host strains for the transformation,a uracil auxotrophic strain EMU6 was isolated by resistance to 5-FOA after UV mutagenesis from EMM.pyrF Gene with 2 553 bp was cloned from strain OPC4 gene.NCBI Result showed that pyrF was an encoding orotate phosphoribosyl transferase gene which affected uracil synthesis.Sequence analysis indicated that,the mutated pyrF gene of EMU6 had one nucleotide deletion at 1 160 bp.The isolation of Talaromyces stipitatus uracil auxotrophic strain makes it possible for construction of the transformation system with pyrF gene.

Keywords：Talaromyces stipitatus;uracil auxotroph;PEG/CaCl2 transformation method;pyrF;UV mutagenesis

周志義，張佑紅，耿安麗.紫外誘變篩選柄籃狀菌尿嘧啶缺陷型菌株[J].化學與生物工程，2016，33(7)：48-51.