鎘累積效應對土壤微生物活性的影響

羅園園，吳雪楠，劉文娟，柴漢魁，姚　俊

(北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083)

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鎘累積效應對土壤微生物活性的影響

羅園園，吳雪楠，劉文娟，柴漢魁，姚俊

(北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083)

摘要：重金屬累積效應是目前重金屬污染土壤的主要形式，研究重金屬多次污染對土壤微生物活性的影響是急需解決的科學問題。研究了外源鎘的累積效應對土壤FDA水解酶活性和微生物能量代謝活性的影響。結果表明，在鎘總量相同時，隨著鎘加入次數的增多，低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘對FDA水解酶活性的促進作用變大，高濃度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)鎘的抑制作用變小，微生物生長速率常數k變大；鎘以少量多次的方式加入土壤，微生物受到反復刺激后生長速率變快，FDA水解酶活性升高。

關鍵詞：鎘；累積效應；土壤微生物；FDA水解酶；能量代謝

土壤是支撐生產活動、調節營養流動、維持陸地生態系統良好運轉的主要場所[1]，其中土壤微生物發揮著重要作用。但人類活動如采礦、冶煉、化石燃料燃燒、施肥等使大量農田土壤受到重金屬污染[2]。土壤中重金屬累積會影響土壤微生物活性[3]。鎘被認為是環境中毒害最大的痕量重金屬元素之一[4]，也因其對土壤微生物的顯著毒性效應成為目前研究最多的重金屬之一。

土壤酶是土壤中十分活躍的有機組分[5]，對土壤中的多種生物化學反應過程起調控作用[6]，是土壤微生物代謝過程的主要媒介[7]。土壤酶的種類有很多，FDA水解酶是其中一種，能夠簡單準確地反映土壤總體微生物活性[8]，可用作短期評估土壤微生物變化的有效工具[9]。微量熱法是近年發展起來的一種研究生物熱力學與生物動力學的重要結構生物學方法[10]。研究發現，微量熱法和土壤呼吸強度、土壤微生物生物量、微生物數量及土壤酶活性有很高的相關性[11]，可作為評價土壤微生物活性的有效手段。

目前，關于添加外源重金屬對土壤微生物活性影響的研究較多，多數停留在一次加入重金屬后測定土壤微生物活性變化情況。但實際環境中重金屬不是一次進入環境中，而是逐步、連續、多次被排放到環境，在此期間土壤微生物會經歷一個反復受重金屬刺激的過程，活性發生變化。Tortella等[12]研究發現，重復向土壤施加有害物質造成的影響或許與一次加入有所不同。李晶等[13]通過比較土壤微生物對一次干擾和二次干擾的不同響應來研究土壤生態系統功能穩定性。Tobor-Kaplon等[14]通過測定細菌生長速率和土壤呼吸情況驗證了劇烈擾動過的系統再次經受外界脅迫的能力會明顯下降的假說，但Philippot等[15]卻指出，第一次干擾反而增加了微生物對抗二次干擾的能力。多項研究結果表明，多次向土壤施加污染物質會影響土壤微生物活性和微生物群落結構[16-20]。

作者研究了鎘濃度對土壤微生物活性的影響及相同濃度鎘以不同添加次數進入土壤后對FDA水解酶、微生物能量代謝的影響，探究鎘累積效應對土壤微生物活性的較長期影響，擬為研究鎘對土壤環境的影響提供參考。

1實驗

1.1土樣

土樣采自北京科技大學校園。采樣深度為0～20 cm，去除表層被草根和顆粒覆蓋的土壤，風干后過100目篩，保存于4 ℃冰箱中備用。土樣的理化性質：pH=7.57，有機質0.73%，速效磷60.0 mg·kg-1，速效鉀120 mg·kg-1，全氮65.0 mg·kg-1。

1.2試劑與儀器

氯化鎘，分析純，天津光復科技發展有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；TAMⅢ型十二通道微量量熱儀，美國TA儀器公司。

1.3方法

取土樣培養于塑料杯中，每份40 g，向其中加入鎘，使土樣中鎘濃度分別為2.0 mg·kg-1、20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1。鎘加入方式分3種：(1)第1 d一次性加入；(2)第1 d、3 d將鎘分2次加入，每次加入總劑量的1/2；(3)第1 d、3 d、5 d將鎘分3次加入，每次加入總劑量的1/3。設置空白對照組。共10份土樣，置于37 ℃恒溫培養箱培養，控制含水率在12%左右。分別在第1 d、7 d、14 d、21 d、28 d測定土樣的FDA水解酶活性，并取第28 d的土樣測定微生物能量代謝活性。

1.4測定方法

1.4.1FDA水解酶活性測定

采用熒光素比色法[5]。每次測定重復3次。

1.4.2微生物能量代謝活性測定

取1 g土樣于4 mL安瓿瓶中，加入200 μL含有5 mg葡萄糖和5 mg硫酸銨的營養液，將安瓿瓶置于微量量熱儀中，記錄土壤微生物的熱功率-時間曲線。

2結果與討論

2.1鎘對FDA水解酶活性的影響

2.1.1鎘濃度與培養時間對FDA水解酶活性的影響(圖1)

圖1　鎘濃度與培養時間對FDA水解酶活性的影響Fig.1　Effects of Cd concentration and culture time on FDA hydrolase activity

從圖1可以看出，在14 d內，低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘對FDA水解酶活性有促進作用；隨培養時間的延長，高濃度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)鎘對FDA水解酶活性起先促進后抑制的作用。這與重金屬和酶的結合機理有關[21],重金屬與酶的結合隨時間變化導致了酶活性也隨時間而改變。

2.1.2鎘累積效應對FDA水解酶活性的影響(圖2)

從圖2可以看出，濃度為2.0 mg·kg-1的鎘分批加入土壤中，第7 d、14 d、28 d時，隨著加入次數的增多，對FDA水解酶活性的促進作用增大，且分3次加入的FDA水解酶活性最高；濃度為20.0 mg·kg-1的鎘分批加入土壤中，第14 d時，隨著加入次數的增多，對FDA水解酶的抑制作用變小，分3次加入的FDA水解酶活性最高；濃度為40.0 mg·kg-1的鎘在第14 d、21 d、28 d對FDA水解酶抑制作用也是隨加入次數的增多而變小。表明，FDA水解酶活性與鎘每次加入量有關。總量一定時，鎘每次加入量與累積加入次數成反比，低濃度鎘對FDA水解酶活性有促進作用。鎘進入土壤后會影響土壤微生物生物量，土壤微生物生物量與重金屬量呈負相關關系[22]，土壤酶活性與土壤微生物生物量呈正相關關系[23]。因此，隨著加入次數的增多，鎘每次加入量越少，FDA水解酶活性越高。這與Li等[7]研究發現FDA水解酶活性與土壤中鎘總量呈負相關關系的結果吻合。

圖2鎘累積效應對FDA水解酶活性的影響

Fig.2Influence of Cd cumulative effect on FDA hydrolase activity

FDA水解酶活性與土壤受鎘干擾的頻次有關。某些微生物對外源鎘的累積加入產生一定的耐受性，累積增多，土壤中微生物抗干擾能力增強，即一次干擾增強了微生物應對二次干擾的能力，導致酶活性較高。相關研究也驗證了這一點，Burges等[24]通過向土樣中分3次加入等量鎘發現，葡萄糖苷酶活性隨加入次數的增多而升高，第2次加入鎘后真菌基因數量較第一次加入后減少，但第3次加入后數量增多，推測原因為土壤中的真菌對鎘進入土壤的頻次較敏感，土壤酶活性和生物量與重金屬侵染的頻次有關。Heuer等[25]向土壤中分3次加入含有磺胺嘧啶的肥料，研究表明，土壤中含抗性基因的微生物反復受到磺胺嘧啶的刺激后累積增多。本研究中，總量相同的鎘進入土壤后，加入次數增多，一些微生物受到刺激后生長較快，累積增多，引起酶活性升高。

鎘濃度為2.0 mg·kg-1時第21 d、鎘濃度為20.0 mg·kg-1時第7 d、21 d、28 d及鎘濃度為40.0 mg·kg-1時第7 d的FDA水解酶活性并未嚴格呈現出隨加入次數的增多而升高的趨勢，可能是因為，微生物群落受到重金屬反復刺激后會發生不穩定變化。Ding等[26]研究發現，向土壤中分3次加入磺胺嘧啶較一次加入時土壤中微生物群落的不穩定性提高，彈性降低。也可能是由于濃度接近的鎘對FDA水解酶活性的影響很小而造成的誤差。但鎘分次加入均比一次加入對FDA水解酶活性的促進作用大、抑制作用小。

2.2鎘對土壤微生物代謝活性的影響

2.2.1鎘濃度與培養時間對土壤微生物微量熱曲線的影響(圖3)

圖3　鎘濃度與培養時間對土壤微生物微量熱曲線的影響Fig.3　Effects of Cd concentration and culture time on microcalorimetric curves of soil microbacteria

由圖3中峰高(最大熱功率Pmax)、出峰時間(最大熱功率時間tmax)可知，低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘對微生物能量代謝有促進作用，高濃度(20.0 mg·kg-1、40.0 mg·kg-1)鎘有抑制作用。

2.2.2鎘累積效應對土壤微生物微量熱曲線的影響(圖4)

由圖4可以看出，總量相同的鎘分次加入土壤后對土壤微生物能量代謝活性的影響是不同的。

2.3鎘累積效應對生長速率常數的影響

生長速率常數(k)是反映微生物化學應力和微生物呼吸的重要參數[27]，可通過對微量熱曲線中對數期部分的lnPt和t的數據按式(1)計算得到(表1)。

lnPt=lnP0+kt

(1)

式中：t是對數期的某一時刻；P0是微生物所有細胞進入對數期時的初始總放熱功率；Pt是t時刻的總放熱功率。

由表1可知，(1)Pmax與加入次數未呈現較好的相關關系。低濃度(2.0 mg·kg-1)鎘影響下的土壤Pmax隨著鎘加入次數的增多而減小，較高濃度(20.0 mg·kg-1)鎘影響下的土壤Pmax先增大后減小，而高濃度(40.0 mg·kg-1)鎘影響下的土壤Pmax呈先減小

圖4鎘累積效應對土壤微生物微量熱曲線的影響

Fig.4Influence of Cd cumulative effect on microcalorimetric curves of soil microbacteria

表1

鎘污染第28 d土壤微生物熱力學參數

Tab.1

Calorimetric parameters of soil microbacteria polluted by Cd in the 28th day

后增大的趨勢。(2)Qtotal與加入次數也未呈現較好的相關關系。這是因為，Pmax和Qtotal與土壤受污染的程度有關。較小程度污染會刺激微生物生長，放熱量增大；但較大程度污染會造成微生物為抵抗外來污染物質消耗更多能量，放出更大熱量。土壤微生物的應對污染的復雜機制導致Pmax和Qtotal未能與鎘的干擾次數顯示較好相關性。(3)鎘分次加入的土壤生長速率常數較一次加入的大。

土壤是復雜的生態系統，對外界侵害有較強的抵抗力。當受到重金屬的反復污染后，為減少背景損傷，部分土壤微生物可通過增強其生物膜進行修復，同時增強代謝活性[28]；重金屬作為一種強選擇壓力使能對其產生抗性的微生物群落增多，土壤生態系統獲得了對抗脅迫的能力，微生物恢復生長較快。

3結論

研究了外源鎘的累積效應對土壤FDA水解酶活性和微生物能量代謝活性的影響。結果表明，低濃度鎘對FDA水解酶活性、微生物能量代謝活性呈促進作用，高濃度鎘總體表現抑制作用。隨著累積干擾次數的增多，總量相同的鎘對FDA水解酶活性的促進作用增大，抑制作用變小，微生物的生長速率常數變大。

由于多次干擾對土壤生態系統產生的影響較為復雜，因此還需更加深入研究微生物的響應機制。重復干擾對土壤微生物活性及土壤生態系統的長遠影響還不清楚，有待深入研究。

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基金項目：國家自然科學基金重點項目(4143000452)，環保部環保公益項目(201409042)

收稿日期：2016-03-08

作者簡介：羅園園(1991-)，女，河北衡水人，碩士研究生，研究方向：土壤環境毒理學，E-mail：996373788@qq.com；通訊作者：姚俊，教授，博士生導師，E-mail：yaojun@ustb.edu.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.07.006

中圖分類號：X 53

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)07-0023-05

Cumulative Effect of Cd on Soil Microbial Activity

LUO Yuan-yuan,WU Xue-lan,LIU Wen-juan,CHAI Han-kui,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering,UniversityofScience&TechnologyBeijing,Beijing100083,China)

Abstract：Nowadays,the cumulative effect of heavy metals on soil is the main form of heavy metal pollution.The impact of repeated heavy metal pollution on soil microbial activity is a scientific problem needed to be solved urgently.The influences of Cd cumulative effect on soil FDA hydrolase activity and microbial energy metabolism activity were studied.Results showed that with the increase of adding times,the low concentration (2.0 mg·kg-1) of Cd activation on FDA hydrolase increased and the high concentration(20.0 mg·kg-1and 40.0 mg·kg-1) of Cd inhibition decreased and the microbial growth rate constant (k) increased.The microbial growth rate accelerated and the FDA hydrolase activity increased under repeated stimulation when Cd was added into the soil more than once.

Keywords：Cd;cumulative effect;soil microbacterium;FDA hydrolase;energy metabolism

羅園園，吳雪楠，劉文娟，等.鎘累積效應對土壤微生物活性的影響[J].化學與生物工程，2016，33(7)：23-27.