湖北省首例輸入性卵形瘧原蟲wallikeri亞種的病原學診斷分析

孫凌聰，張華勛，裴速建，夏　菁，吳冬妮，林　文

(湖北省疾病預防控制中心寄生蟲病防治研究所，武漢 430079)

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湖北省首例輸入性卵形瘧原蟲wallikeri亞種的病原學診斷分析

孫凌聰，張華勛△，裴速建，夏菁，吳冬妮，林文

(湖北省疾病預防控制中心寄生蟲病防治研究所，武漢 430079)

摘要:目的應用巢式PCR技術對1例罕見卵形瘧原蟲wallikeri亞種進行診斷和鑒定。 方法采集初診為輸入性間日瘧患者血樣，進行瘧疾快速診斷試劑盒、顯微鏡鏡檢和巢式PCR檢測，并進行測序分析。 結果該患者瘧疾快速診斷試劑盒檢測陰性；鏡檢查見寄生于紅細胞內的瘧原蟲環狀體和滋養體；采用卵形瘧原蟲wallikeri亞種特異性引物(rOVA1v/rOVA2v)進行巢式PCR，在760 bp處有特異性擴增條帶，測序后經Blast比對，與GenBank數據庫中卵形瘧原蟲wallikeri亞種部分序列的一致性為99%。 結論該患者經巢式PCR和序列分析確診為湖北省首例卵形瘧原蟲wallikeri亞種感染。

關鍵詞:輸入性瘧疾；卵形瘧原蟲wallikeri亞種；巢式聚合酶鏈反應

卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)于1922年首次由Stephens描述并因其在紅細胞內的卵圓形態而被命名[1]。其主要分布于非洲，尤其是西非及東南亞國家。最近研究發現，卵形瘧除經典亞種(Plasmodium ovale curtisi)外還存在另一變異亞種(Plasmodium ovale wallikeri)，兩者無法通過鏡檢從形態上區分[2]。湖北省歷史上未見卵形瘧本地病例報道，但隨著境外勞務輸出的日益頻繁，輸入性卵形瘧呈較大幅度增加，但未見wallikeri亞種報道[3]。本研究對湖北省1例初診為輸入性間日瘧病例，采用巢式PCR鑒定，并進行測序分析，結果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料患者男，31歲，荊門人，2013年11月赴非洲加納從事野外金礦開采，務工期間曾多次感染瘧疾(感染蟲種不詳)，均采用注射1～2 d抗瘧藥治療，2014年8月回國約6個月后，出現發熱、寒戰、全身酸痛等癥狀，經縣人民醫院采血制片鏡檢診斷為間日瘧，后經市級疾控中心鏡檢復核為輸入性間日瘧。采集該患者EDTA-Na2抗凝全血送省級疾控中心復核。

1.2儀器與試劑全血DNA 抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)購自QIAGEN公司，DNA聚合酶(PrimeSTAR?HS DNA Polymerase)購自Takara公司，PCR預混反應體系(DreamTaq PCR Master Mix)購自Fermentas公司，瘧疾快速診斷試劑盒(Malaria rapid diagnostic tests，RDTs)購自廣州萬孚生物技術有限公司。顯微照相系統購自Leica公司，PCR擴增儀和電泳儀購自Bio-Rad公司，凝膠成像系統購自Ultra-Violet公司。

1.3方法

1.3.1RDTs檢測取5 μL患者抗凝血，參照RDTs說明書進行檢測。

1.3.2血涂片顯微鏡鏡檢取患者抗凝血制作有厚、薄血膜的血涂片，干燥、固定后采用Giemsa染色，油鏡(×1 000)下鏡檢瘧原蟲。

1.3.3巢式PCR檢測小亞基核糖體RNA(SSU rRNA)(1)參照文獻[4-5]設計瘧原蟲屬特異性引物rPLU5/rPLU6和間日瘧、惡性瘧、三日瘧、卵形瘧curtisi亞種和卵形瘧wallikeri亞種5種瘧原蟲的種特異引物(分別為rVIV1/rVIV2、rFAL1/rFAL2、rMAL1/rMAL2、rOVA1/rOVA2和rOVA1v/rOVA2v)。由寶生物工程(大連)有限公司合成，見表1。(2)DNA提取參照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取全血DNA，-20 ℃保存。(3)SSU rRNA第一輪擴增：20 μL反應體系中包含3 μL模板DNA，0.2 μL Taq DNA聚合酶，1.1 μL 6 μmol/L屬特異性引物，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，4.0 μL 5×Buffer和9.0 μL水；反應條件為94℃變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共擴增35個循環；72 ℃延伸5 min。SSU rRNA第二輪擴增：20 μL反應體系中包含第一輪擴增產物2 μL，4對種特異性引物上、下游引物各1.0、10 μL 2×DreamTaq PCR Master Mix和補水至20 μL；擴增條件與第一輪擴增相同。(4)瓊脂糖凝膠電泳：取2.0 μL 6×上樣緩沖液與10 μL第二輪PCR擴增產物混勻，取6 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V電泳40 min)，凝膠成像系統觀察。(5)測序分析：將第二輪擴增產物送生工生物(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI上進行Blast同源性分析。

表1　　基于SSU rRNA基因的瘧原蟲巢式PCR擴增體系

2結果

2.1RDTs檢測結果患者抗凝血樣經RDTs檢測，結果為瘧原蟲陰性。

2.2血涂片顯微鏡鏡檢結果血涂片鏡檢厚血膜查見環狀體和大滋養體；薄血膜中，被寄生的紅細胞大小正?；蚵钥s小，環狀體和早期滋養體核較大，胞質較厚，大滋養體呈圓形，細胞質堅實，空泡不顯著(圖1)。

注：A為厚血膜中的環狀體和大滋養體；B～D均為薄血膜，其中B為環狀體，C為早期滋養體，D為大滋養體。

圖1血涂片中的瘧原蟲(Giemsa染色，×1 000)

注：M為DNA標志物；NP-1993為采用NP-1993 PCR體系；Pow為采用卵形瘧wallikeri亞種引物；1為空白對照；2為陰性對照；3～6分別為間日瘧、惡性瘧、三日瘧和卵形瘧curtisi亞種陽性對照；7、8為患者標本。

圖2全血DNA巢式PCR檢測結果

2.3巢式PCR檢測結果采用NP-1933體系，患者樣本擴增陰性；而以rOVA1v/rOVA2v為引物PCR擴增出大小約760 bp的特異性條帶(圖2)。

2.4擴增片段的序列分析結果擴增產物經測序，長度約為754 bp，采用NCBI中Blast程序對擴增序列(通過Bankit提交NCBI，GenBank登錄號為KU315239)進行同源性比對，與GenBank中Plasmodium ovale wallikeri克隆GC-1 18S rRNA基因全序列(GenBank登錄號KF696359.1)及卵形瘧SUU rRNA基因(GenBank登錄號AJ001527.1)一致性均為99%。

3討論

卵形瘧每年在非洲引起超過1 500萬病例，由于其形態與間日瘧相似和隔日發作特點，常被誤診為間日瘧或三日瘧而導致其感染率被低估[6]。而目前被基層廣泛使用的RDTs產品對卵形瘧、三日瘧的診斷敏感性顯著低于間日瘧和惡性瘧，卵形瘧假陰性時常發生[7]。湖北省近幾年才陸續有輸入性卵形瘧報道，基層醫療單位對卵形瘧認識不足，從而導致本例患者誤診為間日瘧。同時，卵形瘧與間日瘧一樣，有肝細胞期休眠子的存在，可導致復發[8]。本研究中的患者回國6個多月才發病，如遇適當的傳播媒介，引起輸入性瘧疾在本地傳播的風險較大。此外，雖然卵形瘧在其流行地區很少引起人類嚴重疾病，但可在外來人群中引起嚴重的臨床疾病[9]。因此，加強基層醫療單位對卵形瘧的認識和診斷能力，對防止漏診和重癥病例發生非常重要。

卵形瘧原蟲兩個亞種形態上無法區分，僅潛伏期長短和潛在臨床癥狀有所區別[10]，只有通過分子生物學方法才能區分。按照中國消除瘧疾行動計劃和瘧疾診斷參比實驗室的相關文件要求，各省應對每個瘧疾病例按照國家瘧疾比實驗室推薦的巢式PCR方法(NP-1993體系[4])進行基因檢測以明確感染蟲種[11]。但研究發現，自wallikeri亞種被發現并正式命名后，傳統的NP-1993體系僅對curtisi亞種敏感[12]。隨后針對新亞種卵形瘧的診斷技術和方法也不斷更新，并取得了很多成果[3]。本研究中患者采用NP-1993體系進行巢式PCR檢測陰性后，采用Calderaro等[5]報道的卵形瘧原蟲wallikeri亞種特異性引物(rOVA1v/rOVA2v)，擴增出特異性條帶。擴增產物測序后在NCBI上進行同源性比對，確診為卵形瘧wallikeri亞種。

隨著中國前往非洲、東南亞等地區務工人員不斷增多，我國輸入性瘧疾疫情逐年上升，一些國內較為少見的瘧疾類型，如三日瘧、卵形瘧及諾氏瘧原蟲。也不斷增多[11]。湖北省2013年后已無本地瘧疾病例報告，但隨著輸入性瘧疾不斷增多，卵形瘧病例顯著增加[4]。因此，加強基層醫療單位對少見瘧疾種類的培訓，并在傳統鏡檢、RDTs方法基礎上，結合PCR等分子生物學診斷技術，對降低少見輸入性瘧疾病例的漏診、誤診，減少重癥病例發生及防止輸入性瘧疾在本地傳播，鞏固消除瘧疾的成果有重要意義。

參考文獻

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作者簡介：孫凌聰，男，主管檢驗技師，主要從事寄生蟲病檢測、防治與研究。 △通訊作者，E-mail：530777955@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.022

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1956-03

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-20)

Analysis on etiological diagnosis of first case of imported Plasmodium ovale wallikeri subspecies in Hubei Province

SUNLingcong,ZHANGHuaxun△,PEISujian,XIAJing,WUDongni,LINWen

(ResearchInstituteofParasiticDiseases,HubeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan,Hubei430079,China)

Abstract:ObjectiveTo use the nested PCR technology to diagnose and identify a case of imported Plasmodium ovale wallikeri subspecies.MethodsBlood sample was collected from 1 case of initially diagnosed imported tertian malaria and performed the examination of microscopy,rapid diagnostic tests (RDTs) and nested-PCR.Moreover the sequencing was conduced.ResultsRDTs showed the negative result;the ring form and trophozoite of Plasmodium could be observed in the blood smear by microscopy;the Plasmodium ovale wallikeri subspecies specific primer rOVA1v/rOVA2v was adopted for conducting nested PCR,the specicific amplification band appeared at 760 bp,after sequencing and Blast aligning,its coincidence with the partial sequence of Plasmodium ovale wallikeri subspecies in the Genbank database was 99%.ConclusionThis patient is the first case of Plasmodium ovale wallikeri subspecies infection in Hubei province by nested PCR and sequencing analysis.

Key words:imported malaria;plasomdium ovale wallikeri;nested polymerase chain reaction