人BRIT1基因在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義分析*

麥　力，王　玎，胡　琴，聶　紅，趙　清，陳維賢，鄧淋曼

(重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科　400010)

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人BRIT1基因在宮頸癌組織中的表達及其臨床意義分析*

麥力，王玎，胡琴，聶紅，趙清，陳維賢，鄧淋曼△

(重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科400010)

摘要:目的檢測宮頸癌組織和配對的宮頸非癌組織中的BRIT1表達情況，比較兩者之間的表達差異。方法分別應用實時熒光PCR(RT-PCR)、免疫組化技術檢測宮頸癌組織及其配對的宮頸非癌組織中BRIT1 mRNA和蛋白的表達水平，分析BRIT1蛋白表達水平與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤類型、腫瘤的病理分級和臨床分期之間的關系。結果RT-PCR結果揭示宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達水平低于配對的宮頸非癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)；免疫組化技術結果揭示63例標本中的44例(69.8%)宮頸癌組織BRIT1蛋白表達水平低于配對的宮頸非癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)；在高級的病理分級和臨床分期中，BRIT1蛋白的表達減少更為明顯。結論BRIT1在宮頸癌癌組織和非癌組織中的表達差異提示BRIT1可能在宮頸癌的發生、發展中具有一定的作用。

關鍵詞:BRIT1；宮頸癌；免疫組化；實時熒光定量PCR

宮頸癌是癌細胞起源于子宮頸的惡性腫瘤，又稱子宮頸癌。宮頸癌是全球第三位高發的女性惡性腫瘤，是引起全球女性死亡的第四大“腫瘤殺手”[1]。據世界衛生組織統計，僅2010年全球新發宮頸癌病例52.9萬，死亡病例27.5萬，病死率高達52%，其中88%的死亡病例發生在發展中國家[1]。宮頸癌是導致女性死亡的一個主要疾病。因此，進一步研究宮頸癌發生、發展的分子機制，研究開發新的宮頸癌診斷和治療方法，具有重要的理論和現實意義。BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression)又稱MCPH1(microcephalin)，是以大腦體積減小及智力遲鈍為特征的原發性小頭畸形的主要致病基因之一，因此該基因也稱作小腦癥基因[2]。目前研究證實BRIT1基因是DNA損傷應答通路中一個重要分子[3]。DNA損傷應答是機體早期抵御腫瘤發生的重要防線，因此推測BRIT1在腫瘤的發生、發展中扮演著重要作用。然而目前，BRIT1在宮頸癌組織中的表達和其潛在功能尚未得到證實。因此研究BRIT1在宮頸癌組織中的表達及臨床意義，對認識宮頸癌的發生和發展機制有著重要的理論意義，同時可能為宮頸癌的診斷和靶向治療提供重要的理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料63對宮頸標本包括宮頸癌組織和同一病例的宮頸非癌組織，采集于重慶醫科大學附屬醫院。所有標本的病理資料包括患者年齡、腫瘤分型、腫瘤大小、腫瘤的病理分級和臨床分期等。每份組織標本分成2份：一份由4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片用于免疫組織化學分析；另一份液氮凍存，用于提取總RNA，用于實時熒光PCR(RT-PCR)分析。

1.2試劑RNA提取試劑盒Trizol購自美國Invitrogen公司，cDNA逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司，BRIT1一抗購自Abcam公司；HRP標記的IgG二抗購自北京鼎國生物技術公司；免疫組化試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.3方法

1.3.1PCR檢測宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達提取宮頸組織中的RNA，在逆轉錄酶作用下合成cDNA，將cDNA稀釋10倍后進行RT-PCR反應。反應體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL， cDNA模板1 μL，ddH2O 3.8 μL。引物序列如下：BRIT1引物正義鏈 5′- AGT GGG AGA GGC AAA AAG CC-3′，反義鏈 5′-GTT CGA ACG GCT CCT CAG AA-3′；GAPDH引物正義鏈 5′-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TT-3′，反義鏈 5′-CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3′。反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環，相同試驗重復3次。

1.3.2免疫組化宮頸癌組織中BRIT1蛋白水平的表達宮頸癌組織石蠟包埋、切片，制作免疫組化組織片。免疫組化過程為：脫蠟，切片經二甲苯洗3次，每次5 min，再水化；抗原修復，檸檬酸抗原修復液(pH6.0)100 ℃，20 min；5%的山羊血清封閉；BRIT1一抗4 ℃孵育過夜；HRP 標記的IgG二抗25 ℃孵育30 min；鏈霉親和素-過氧化物酶孵育30 min；DAB顯色；顯微鏡觀察，結果判讀。由2位病理醫生在不知曉臨床病理參數的條件下，對免疫組化的結果進行量化打分。量化分值根據染色陽性細胞比率和染色強度進行綜合量化。其中染色強度的打分標準如下：陰性(-，0分)，弱陽性(+，1分)，中等陽性(++，2分)，強陽性(+++，3分)。染色陽性細胞比率的打分標準如下：陽性細胞比率≤10%(0分)，10%<陽性細胞比率≤30% (1分)，30%<陽性細胞比率≤50%(2分)，50%<陽性細胞比率≤70%(3分)，70%<陽性細胞比率≤100%(4分)?？偡种?0～7分)= 染色強度的分值+染色陽性細胞比率的分值。

2結果

2.1宮頸癌標本BRIT1 mRNA的表達采用RT-PCR檢測31對宮頸組織中BRIT1 mRNA的表達情況，在31例標本中有19例(61.3%)宮頸癌組織標本的BRIT1 mRNA的表達水平低于其配對的宮頸非癌組織的表達，統計分析證實宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達量比宮頸非癌組織中的表達量低(P=0.000 2)，見圖1。

圖1　　宮頸標本BRIT1 mRNA表達水平的比較

圖2　　宮頸標本BRIT1蛋白表達水平的比較(400×)

圖3　　宮頸組織中BRIT1蛋白的表達水平

2.2免疫組化檢測宮頸癌標本BRIT1蛋白的表達采用免疫組化技術檢測63對宮頸癌標本中BRIT1蛋白的表達水平，各組織標本的BRIT1蛋白的表達量化評分和經統計分析后，結果顯示：63例標本中的44例(69.8%)宮頸癌組織BRIT1蛋白的表達水平低于配對的宮頸非癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2；宮頸鱗癌組織和宮頸腺癌組織中BRIT1蛋白的表達均低于各自配對的宮頸非癌組織中BRIT1蛋白的表達，見圖3。宮頸癌中BRIT1的表達量與腫瘤分級、腫瘤分期有相關性，差異有統計學意義(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分型等沒有相關性，見表1。

表1　　BRIT1蛋白表達水平與臨床病理資料的相關性分析*

注：*BRIT1蛋白表達水平為免疫組化法檢測量化打分結果，≤3分為低表達，>3分為高表達；aP<0.05，與腫瘤分級3級比較；bP<0.05，與腫瘤分期Ⅲ期比較。

3討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，是威脅女性健康最常見的“腫瘤殺手”。因此，進一步研究宮頸癌發生發展的分子機制將有助于宮頸癌診斷和治療。而BRIT1在宮頸癌組織的表達和功能目前尚未證實。

BRIT1基因是一個新的關鍵的DNA損傷應答基因，可調控ATM/ATR信號通路，修飾染色體結構，直接參與DNA修復等過程。DNA損傷應答信號的正常激活是早期阻止腫瘤發生的重要機制，是抵御細胞內外損傷因子損傷基因組DNA的重要防線[4]。而BRIT1正是DNA損傷應答信號通路中的關鍵一環，且處于DNA損傷應答的早期階段。多個研究小組已證實：在乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、前列腺癌[7]及慢性粒細胞白血病[8]等腫瘤組織中，BRIT1表達減少。此外，在BRIT1基因敲除的小鼠中，其基因組的不穩定性增加，腫瘤的易感性增加[9]。這些研究提示BRIT1可能是一個新的腫瘤抑制基因。因此，研究BRIT1在宮頸癌組織的表達及其功能有助于宮頸癌對腫瘤發生、發展的分子機制的認識；有利于提高宮頸癌的早期診斷和治療。

本研究采用RT-PCR和免疫組化技術從mRNA和蛋白水平兩個方面證實了BRIT1在宮頸癌組織中的表達低于宮頸非癌組織中的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。RT-PCR結果顯示：在31例標本中有19例(61.3%)宮頸癌組織中BRIT1 mRNA的表達低于配對的宮頸非癌組織的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。免疫組織化學結果根據染色強度和陽性細胞比率進行量化評分后統計分析，結果顯示：63例標本中的44例(69.8%)宮頸癌組織BRIT1蛋白表達水平低于配對的宮頸非癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)。在mRNA水平和蛋白水平，宮頸癌組織較配對的宮頸非癌組織BRIT1的低表達率基本一致，均在60%以上。這一結果提示BRIT1在宮頸癌組織的低表達可能與BRIT1基因在轉錄水平和轉錄后水平的表達調控失衡有關，如啟動子區域的DNA甲基化、miRNA的調控失衡等。統計分析揭示，宮頸癌中BRIT1的表達量與腫瘤的病理分級和臨床分期有一定的相關性，與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分型等沒有相關性。這一結果提示BTIT1可能是宮頸癌細胞惡性程度的一個重要標志。此外，有多個報道顯示BRIT1在其他腫瘤組織中也呈低表達，如Richardson等[5]研究表明在319例乳腺癌標本中，有93例乳腺癌標本中BRIT1的表達低于其配對的正常乳腺的表達，其低表達率為29%，且BRIT1的表達量與腫瘤分級呈負相關；而也有研究證實BRIT1的表達與乳腺癌的轉移[10]和無復發生存時間呈負相關[11]。另有報道BRIT1在30例卵巢癌標本中有19例的癌組織較配對正常組織呈低表達[12]。在人體中，BRIT1基因定位于染色體8p23.1，在腫瘤細胞中這一區帶易于雜合性缺失，這個可能是BRIT1在多個腫瘤組織中的表達缺失的重要原因。此外，BRIT1的表達缺失也可能與其轉錄水平和轉錄后水平的表達調控失衡有關，需進一步研究。這些研究結果進一步證實了BRIT1可能是一個新的抑癌基因，參與抑制腫瘤的發生、發展。BRIT1在宮頸癌組織和宮頸非癌組織中的差異表達，提示BRIT1可能在宮頸癌發生、發展具有重要的作用，為進一步研究其作用奠定了基礎。

參考文獻

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* 基金項目：重慶市衛生和計劃生育委員會項目(2013-2-046)。

作者簡介：麥力，男，主管檢驗技師，主要從事腫瘤分子生物學研究。 △通訊作者，E-mail:denglinmancqmu@126.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.002

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)14-1904-03

(收稿日期：2016-01-08修回日期：2016-03-21)

Analysis of human BRIT1 expression and its clinical significance in cervical cancer*

MAILi,WANGDing,HUQin,NIEHong,ZHAOQing,CHENWeixian,DENGLinman△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the expression of BRIT1 in cervical cancer tissues and cervical noncancer tissues,and to analyze the differences between the two tissues.MethodsThe expression of BRIT1 mRNA and protein in cervical cancer tissues and the paired cervical noncancer tissues was evaluated by RT-PCR and immmunohistochemistry.Its correlation with the clinicopathological parameters including age,tumor types,size,tumor pathological grade and clinical stage was analyzed.ResultsRT-PCR results showed that the BRIT1 mRNA level in cervical cancer tissues was significantly lower than that in the paired cervical noncancer tissues,the difference was statistically significant(P<0.05).The immmunohistochemistry results showed that the BRIT1 protein expression level in 44 cases of 63 (69.8%) samples wa slower than that in the paired cervical noncancer tissues,the difference was statistically significant(P<0.05);In high pathological grades and high clinical stages,the decrease of BRIT1 protein expression was more significant.ConclusionThe difference of the BRIT1 expression between the cervical cancer tissues and cervical noncancer tissues suggests that BRIT1 may play a certain role in the occurrence and development of cervical cancer.

Key words:BRIT1；cervical cancer；immmunohistochemistry；real time-PCR