酪氨酸激酶抑制劑高劑量脈沖式給藥克服非小細胞肺癌獲得性耐藥的體外觀察研究

萬宜濤，袁 媛，潘躍銀，張 穎

酪氨酸激酶抑制劑高劑量脈沖式給藥克服非小細胞肺癌獲得性耐藥的體外觀察研究

萬宜濤1，袁 媛2，潘躍銀3，張 穎1

目的 探討吉非替尼高劑量脈沖式給藥作用于非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞株PC9/GR的抗腫瘤效應及其可能機制。方法 MTT法檢測吉非替尼對PC9/GR的增殖抑制率，計算半數抑制濃度（IC50），根據IC50值，分為吉非替尼常規劑量給藥組和脈沖式劑量給藥組，分別作用于PC9/ GR細胞株，熒光顯微鏡觀察各處理組中細胞凋亡形態學變化，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測表皮生長因子受體（EGFR）相關信號通路蛋白如p-EGFR、EGFR、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）、AKT、磷酸化的細胞外調節蛋白激酶（p-ERK）、ERK表達水平。結果 與對照組比較，高劑量脈沖式給藥組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），同時可明顯下調p-EGFR、p-ERK、p-AKT蛋白表達（P ＜0.05）。結論 吉非替尼高劑量脈沖式給藥在一定程度上可以顯著抑制PC9/GR細胞增殖，促進細胞凋亡，機制可能與阻斷EGFR信號通路傳導有關。

非小細胞肺癌；獲得性耐藥；吉非替尼

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.026.htm l

據2014年我國腫瘤統計數據可知，肺癌發病率、死亡率分別為46.08/10萬，37/10萬，在腫瘤中排名第一［1］。其中約80%為非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）陽性突變率占NSCLC患者50%以上，為研究重點及熱點［2］。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tryosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）對晚期NSCLC患者療效已被證實［3-4］，但耐藥問題幾乎不可避免［5］。在初始對吉非替尼敏感的患者，再次出現疾病進展后，予以TKIs高劑量脈沖式給藥在一定程度上可延緩疾病發展，同時對劑量增加伴隨的不良反應可很好地耐受［6］。而減少吉非替尼劑量可能導致EGFR突變陽性者耐藥規律的提前出現［7］。但相關作用機制尚未見報道。該研究以吉非替尼耐藥細胞株PC9/GR為研究對象，觀察吉非替尼不同給藥方式對其的增殖凋亡及相關EGFR信號通路變化情況，初步探討可能作用機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC PC9/GR為廣東省肺癌研究所惠贈；吉非替尼為英國Astra Zeneca公司惠贈，用DMSO溶液稀釋為母液（終溶度為10 mmol/L），在-80℃冰箱凍存，待實驗時再稀釋至目標溶度，DMSO的終溶度小于0.1%；胎牛血清、高糖DMEM培養基購自美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素購自哈藥集團；MTT粉、DMSO購自美國Sigma公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博公司；p-EGFR、EGFR、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphorylated serine/threonine kinase，p-AKT）、AKT、磷酸化的細胞外調節蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）、ERK抗體購自美國Cell Signal Technology公司；β-actin及二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光劑購自美國Millipore公司。

1.2 細胞培養 PC9/GR細胞用含10%胎牛血清、含1%雙抗（100 U/m l青霉素和100μg/ml鏈霉素）的高糖DMEM培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，1～2 d換液、胰蛋白酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 M TT法檢測吉非替尼對PC9/GR細胞增殖的影響 取對數生長期的PC9/GR細胞，以5×104個/m l，每孔各100μl，接種于96孔板中。細胞培養24 h細胞貼壁后，實驗組加入吉非替尼（0.390、0.780、1.560、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000μmol/L）。對照組加入培養基。72 h后，加入20μl MTT（終質量濃度為5 mg/m l），繼續培養4 h，當肉眼見藍紫色結晶后，加入150μl/孔DMSO，振蕩10 min，溶解結晶，在酶聯免疫檢測儀上檢測各孔在490 nm波長處的吸光度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率。計算吉非替尼對PC9/GR的半數抑制濃度（half inhibitoryconcentration，IC50）值；每孔設置6個復孔，實驗重復至少3次。

1.4 Annexin V-FITC熒光染色觀察細胞凋亡形態的變化 取對數生長期的PC9/GR細胞，以1×10接種于6孔板，每孔2 ml。根據IC50值給予不同藥物溶度，具體實驗為對照組（僅含細胞和培養液，不含藥物）、常規IC50藥物溶度組、2倍IC50藥物溶度脈沖給藥組、4倍IC50藥物溶度高劑量脈沖給藥組。經藥物處理后，去上清液，PBS洗滌細胞，按照說明書加入預混試劑，覆蓋6孔板的底面，室溫下避光反應10 min，在熒光顯微鏡下觀察及拍照。實驗至少重復3次。

1.5 流式細胞術檢測PC9/GR細胞的凋亡率變化

取對數生長期 PC9/GR細胞，1×105密度接種于6孔板，每孔2 ml。實驗分組如上所述。待藥物處理后，收集胰酶消化后的細胞，PBS洗滌2次，1 600 r/min離心5min收集細胞，加入10μl Annexin V和5μl PI做標記，震蕩混勻后，室溫避光孵育15 min，PBS洗2遍后，加400μl Binding buffer懸浮細胞，混勻，流式細胞術檢測PC9/GR細胞的凋亡率。實驗至少重復3次。

1.6 Western blot法檢測EGFR信號通路相關蛋白表達 取對數生長期的PC9/GR細胞，接種于100 mm2的培養皿中；實驗分組如上。收集處理后的PC9/GR細胞，PBS洗滌細胞3次，細胞裂解液提取細胞蛋白，根據BCA法確定蛋白質濃度。取50 μg/孔蛋白樣品上樣，予10%SDS-PDGE電泳分離，電泳后將蛋白質轉至PDVF膜，經5%脫脂奶粉室溫封閉約1～2 h后，加入一抗（1∶1 000）和β-actin抗體，4℃過夜。TBST洗膜3遍后，加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫反應1 h，TBST再次洗膜3次，每次10 min后，加入ECL，暗室中顯影、定影。實驗至少重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量數據以±s表示。多組間均數的比較采用單因素方差分析。各實驗重復3次。

2 結果

2.1 吉非替尼對PC9/GR細胞的增殖抑制作用吉非替尼對PC9/GR細胞的增殖有抑制作用，根據MTT結果，生長抑制-藥物溶度呈劑量依賴性生長抑制。吉非替尼作用于PC9/GR 72 h后的IC50值是（5.44±0.91）μmol/L，與對照組比較，差異有統計學意義（F=270，P＜0.01）。以后實驗分組依據IC50值分為對照組（僅含細胞和培養液，不含藥物）、常規IC50藥物溶度組、2倍IC50藥物溶度脈沖給藥組、4倍IC50藥物溶度高劑量脈沖給藥組，即對照組、5、10、20μmol/L組。見圖1。

圖1 MTT法檢測吉非替尼對　PC9/GR細胞增殖抑制率

2.2 熒光顯微鏡下觀察吉非替尼處理后PC9/GR細胞凋亡形態的變化 熒光顯微鏡下觀察顯示，與對照組比較，5μmol/L和10μmol/L組可見綠色熒光（早期凋亡細胞）增多，而20μmol/L組，細胞核或細胞質中可見紅色熒光（晚期凋亡細胞），同時細胞形態較其他處理組明顯不規則。見圖2。

2.3 流式細胞術檢測PC9/GR細胞的凋亡率變化

據檢測結果顯示，PC9/GR中，對照組、5μmol/L組、10μmol/L組、20μmol/L組凋亡率分別是（2.24 ±1.71）%、（5.39±1.18）%、（7.44±2.03）%、（22.4±1.46）%。與對照組比較，差異有統計學意義（F=90.90，P＜0.05）。實驗結果顯示20μmol/L組凋亡率明顯強于其他組，因此，推測高劑量脈沖給藥可能增強細胞促凋亡作用。見圖3。

2.4 W estern b lot法檢測EGFR信號通路相關蛋白的表達 在耐藥細胞株PC9/GR細胞中，與對照組比較，20μmol/L組較5μmol/L及10μmol/L組，p-EGFR、p-AKT、p-ERK蛋白水平明顯下降，差異有統計學意義（F=579.30、52.04、104.50，P＜0.05）。各處理組細胞中，EGFR、AKT、ERK的表達水平差異無統計學意義（F=0.230、3.377、3.648）。見圖4。

圖2 Annexin V-FITC熒光染色觀察不同劑量吉非替尼處理組中PC9/GR細胞凋亡形態的變化　×400A：對照組；B：5μmol/L組；C：10μmol/L組；D：20μmol/L組

圖3 流式細胞術檢測不同劑量吉非替尼對PC9/GR細胞凋亡率的影響A：對照組；B：5μmol/L組；C：10μmol/L組；D：20μmol/L組

3 討論

據美國肺癌聯盟報道，超過60%的NSCLC患者體內，檢測到驅動基因的存在，且驅動基因間存在互排［8］。由公布的最新中國NSCLC患者驅動基因譜可知，EGFR的突變仍是中國肺腺癌最常見的驅動基因。因此，阻斷EGFR信號通路被認為是治療NSCLC的關鍵所在。

吉非替尼為阻斷EGFR信號通路的經典藥物。2003年被美國食品藥品局批準臨床用于治療晚期NSCLC患者。其通過與ATP競爭EGFR催化區域上的結合位點，阻止EGFR靶點激活，進一步阻斷下游諸如MEK/ERK、PI3K/AKT等信號傳導，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖［9］。但不幸的是，初始敏感的NSCLC患者均易復發及轉移。

近年來，Grommes et al［10］發現在9例EGFR-TKIs治療失敗的肺癌腦轉移患者中，給予厄洛替尼脈沖式給藥1 500 mg/周，有6例患者獲得部分緩解，1例獲得穩定，另有2例出現疾病進展，推測脈沖治療的療效與EGFR基因突變類型相關。研究［11］顯示，在對吉非替尼耐藥后，部分患者換用厄洛替尼仍可獲益。因此推斷EGFR突變患者在對EGFR-TKIs耐藥后，仍然存在對EGFR-TKIs敏感細胞，依賴EGFR信號通路，但因為耐TKIs細胞增加，原有劑量的 TKIs劑量不足以抑制 EGFR信號轉導活性?？梢岳妹}沖式給藥，即通過在短時間內大劑量給藥，在疾病發生過程中迅速達到有效的更高的血藥溶度來再次抑制酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR信號通路，在一定程度上克服EGFR-TKIs耐藥。

研究［12］表明EGFR在許多惡性腫瘤中存在異常表達或過度表達，其作為上皮生長因子信號轉導受體，參與多種腫瘤細胞的侵襲轉移、血管生成、細胞增殖及細胞凋亡。EGFR信號通路激活可以進一步促進下游信號通路PI3K-AKT、RAS-RAF-MEKERK等［13］。由文獻［14］可知AKT通過調節細胞周期依賴性蛋白激酶誘導細胞DNA合成；通過抑制Caspase及影響BCL-2家族等誘導細胞凋亡。同時ERK信號的激活可通過級聯反應放大信號作用于核轉錄因子如NF-кB等調控基因表達，促進細胞增殖［15］。故只有同時阻斷PI3K-AKT、MEK-ERK信號通路才能克服耐藥。

圖4 W estern blot法檢測不同劑量吉非替尼對PC9/GR細胞EGFR信號通路的影響A：對照組；B：5μmol/L組；C：10μmol/L組；D：20μmol/L組

本研究顯示在肺癌耐藥細胞株PC9/GR 20 μmol/L組中p-EGFR、p-AKT、p-ERK蛋白表達水平較5μmol/L組和10μmol/L組明顯下調。推斷提高藥物的有效血藥溶度可能進一步增加吉非替尼與EGFR突變位點的靶向結合，增加對ATP與EGFR結合位點的抑制性，阻斷EGFR信號通路，從而抑制其下游信號通路PI3K-AKT、RAS-RAF-MEK-ERK等。而5μmol/L組和10μmol/L組效果不佳，可能是由于目前的血藥溶度不足以抑制EGFR信號通路的轉導。此外在細胞凋亡的形態學觀察和流式細胞術檢測結果中也佐證，高劑量脈沖式給藥模式有明顯的促進細胞凋亡的作用。

本研究結果顯示吉非替尼高劑量脈沖式給藥可以克服EGFR-TKIs繼發性耐藥，其機制可能與阻斷EGFR信號通路有關，從而進一步下調PI3K-AKT、RAS-RAF-MEK-ERK等信號通路，為臨床高劑量脈沖式治療NSCLC患者提供實驗依據。但由于本實驗為體外研究，因此臨床應用具體劑量、應用人群尚需進一步探索。

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H igh-dose pulsatile epidermal grow th factor receptors tryosine kinase inhibitor overcome the acquired resistance in non-small-cell lung cancer in vitro

Wan Yitao1，Yuan Yuan2，Pan Yueyin3，et al
（1Dept of CadresWard，The Third Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230061；
2Central Laboratory of Binhu Hospital，Hefei 230061；
3Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To study the antitumor activity of high-dose pulsatile gefitinib administration on non-small cell lung cancer PC9/GR cell and its potentialmechanisms.Methods The proliferation inhibitory effectof different concentrations ofgefitinib on PC9/GR cellswasmeasured with MTTassay and the value of IC50was calculated.According to IC50value，we divided the experiment into the routine gefitinib administration group and gefitinib high dose pulsatile administration group on PC9/GR cell.The cell apoptosismorphological change was detected by the fluorescentmicroscope.The flow cytometry was used to analyze the alteration of cell apoptosis rate.ERFR signal related protein such as p-EGFR，EGFR，p-AKT，AKT，p-ERK and ERK weremeasured using Western blot.Results Compared with the control group，the apoptosis rates weremarkedly increased when treated with high dose pulsatile gefitinib（P＜0.01）.Western blot results showed that，compared with the control group，gefitinib clearly decreased the expressions of p-EGFR，p-AKT，p-ERK when treated with high dose pulsatile gefitinib（P＜0.05）. Conclusion High-dose pulsatile gefitinib can significantly inhibit the cell proliferation and induce cell apoptosis. Themechanism of antitumor effectmay be due to themutual interference with the EGFR signaling pathway.

non-small cell lung；drug therapy；gefitinib

R 734.2

A

1000-1492（2016）04-0516-05

2015-12-21接收

安徽高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2012A157）；安徽省科技攻關項目（編號：1301042214）；安徽省“十二五”臨床重點?？平ㄔO項目（編號：03P55）

1安徽醫科大學第三附屬醫院干部病房，合肥 230061
2合肥市濱湖醫院中心實驗室，合肥 230061
3安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，合肥 230022

萬宜濤，女，碩士研究生；
潘躍銀，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：yueyinpan1965@126.com；
張 穎，女，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhangying19650108@163.com