4種自身抗原與狼瘡性腎炎相關(guān)性的CrELISA分析

胡桑，譚杰文，喬玉莉，龔祖康，黃渝，廖維芳，周素芳，陳志堅，蘇家光，林文珍1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西南寧，0021；2.廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西南寧，0021；.南寧急救醫(yī)療中心，廣西南寧，0001；.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣西南寧，0021；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，廣西南寧，0021

論著

4種自身抗原與狼瘡性腎炎相關(guān)性的CrELISA分析

胡桑1，2，譚杰文1，2，喬玉莉1，2，龔祖康3，黃渝1，2，廖維芳1，2，周素芳1，2，陳志堅4，蘇家光5，林文珍1，2
1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西南寧，530021；2.廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西南寧，530021；3.南寧急救醫(yī)療中心，廣西南寧，530001；4.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，廣西南寧，530021；5廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，廣西南寧，530021

目的分析4種自身抗原與狼瘡性腎炎（LN）的相關(guān)性，以尋找具有更高敏感性與特異性的特征性自身抗原。方法收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科2013年7月—2014年7月期間的患者血清120例，其中正常人血清、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者血清、LN患者血清及腎病綜合征（NS）患者血清各30例。以CrELISA法檢測四種陽性抗原蛋白在各組血清中的表達(dá)情況，并以生物信息學(xué)分析結(jié)果。結(jié)果 A1、A2在SLE組中的表達(dá)量（0.67±0.36）、（0.31±0.18）相對在正常人組中的表達(dá)量（0.47±0.24）、（0.22±0.10）與NS組中的表達(dá)量（0.33±0.17）、（0.19±0.10）更高（P＜0.05），與LN組中的表達(dá)量（0.53±0.27）、（0.27±0.14），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 4種抗原中，A1、A2的敏感性相對較高，更可能是SLE/LN的特征性自身抗原，有望成為SLE/LN的診斷依據(jù)。

狼瘡性腎炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；自身抗原；CrELISA法

［Abstract］Objective To assess the relevance of four autoantigens to lupus nephritis（LN），and find out some more sensitive and specific characteristic autoantigens.Methods Sera were acquired from Laboratory Department of the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University in July 2013 to July 2014，containing 30 normal sera，30 systemic lupus erythematosus（SLE）patients'sera，30 LN patients'sera and 30 nephrotic syndrome（NS）patients'sera.The normal group came from healthy examinees.The SLE group was collected according to SLICC Revision of the ACR Classification Criteria for SLE.The LN group came from those SLE patients with renal lesions.The NS group came from NS patients without SLE.Crude lysate enzyme-linked immunosorbent assay（CrELISA）was used to detect potential antigens'expression levels in each group.Bioinformatics method was used to analyze the results.Results Expression levels of A1 and A2 in SLE group（0.67±0.36），（0.31±0.18）are statistically higher than those in normal group（0.47±0.24），（0.22±0.10）and NS group（0.33±0.17），（0.19±0.10）（P＜0.05），but similar to those in LN group（0.53±0.27），（0.27±0.14）（P＞0.05）.Conclusion Among these four autoantigens，A1 and A2 suggest higher sensibility，which make them the more possible characteristic autoantigens of SLE/LN and hopeful diagnostic basis.

［Key words］lupus nephritis；Systemic lupus erythematosus；Autoantigen；Crude lysate ELISA

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，由于免疫功能紊亂使體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體，導(dǎo)致皮膚、粘膜、肌肉、血管等多系統(tǒng)、多器官損害。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE累及腎臟所引起的一種免疫復(fù)合物性腎炎，是SLE的主要合并癥，也是引起SLE患者死亡的主要原因［1］。目前尚未有SLE/LN的治愈方法，只能依靠早診斷早治療，以控制病情，延長患者壽命。

LN的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，易與其他類型腎病混淆，目前最準(zhǔn)確的診斷方法腎穿刺活檢因其創(chuàng)傷性及部分患者的身體原因而不易推廣。在診斷的另一途徑免疫學(xué)檢查中，靶抗原為dsDNA，Sm，ANAC，C1q等的抗體作為常用檢測指標(biāo)［2-3］，對疾病在不同階段的特異性或敏感性尚有不足［4-5］，因此更高效的特征性自身抗原還有待發(fā)掘。

前期課題組以SEREX技術(shù)篩選到與LN可能相關(guān)的自身抗原A1（TMEM158）、A2（unknown）、B2（PR PF40A）、Q10（CIAO1），為了檢測其特異性，本文以CrELISA法檢測已篩選到的4種可能相關(guān)自身抗原，在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科2013年7月—2014年7月期間收集的120例患者血清中的表達(dá)情況［6］，以分析抗原與疾病的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

導(dǎo)入了陽性抗原A1（TMEM158）、A2（unknown）、B2（PRPF40A）、Q10（CIAO1）的pBluescript質(zhì)粒的大腸桿菌XLOLR來自廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室林文珍老師課題組。IPTG購自Merck公司，蛋白酶抑制劑購自AppliChem公司，HEPES和對硝基苯磷酸二鈉購自Amresco公司，羊抗人IgG-AP購自Jackson公司，BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

血清樣本是在2013年7月—2014年7月間從廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科收集，并獲得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并經(jīng)患者同意及簽署知情同意書。SLE組血清采集參照SLICC-SLE分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，其中滿足腎臟病變者的血清作為LN組。正常人組來自健康體檢人群，腎病綜合征 （nephrotic syndrome，NS）組來自未患SLE的NS患者。所得血清中SLE組有30例（男9例、女21例），年齡范圍17～43歲，平均年齡（23.9±5.9）歲；LN組30例（男11例、女19例），年齡范圍20～46歲，平均年齡（28.2±6.1）歲；正常人組30例（男15例、女15例），年齡范圍25～40歲，平均年齡（31.4±5.1）歲；NS組30例（男18例、女12例），年齡范圍21～60歲，平均年齡（33.5±10.3）歲。所有的樣本貯存于-80℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時間的確定 將導(dǎo)入了陽性抗原pBluescript質(zhì)粒的大腸桿菌XLOLR以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至A600～0.35，加入2 mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。分別取0、2、3、4、5、6 h培養(yǎng)液（其中0 h培養(yǎng)液中未含有IPTG，將之取出后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h），離心后細(xì)胞重懸于PBS（pH 7.2，含有0.2 mM蛋白酶抑制劑）并反復(fù)凍融5～6次，將蛋白裂解液進(jìn)行SDS-PAGE，檢測不同時間的蛋白表達(dá)量。

1.2.2包被抗原濃度的確定BCA法檢測蛋白含量。蛋白裂解液以包被液（100 mM HEPES，pH 7.2）稀釋至不同濃度 （5、10、20、40、80 μg/mL），50 μL/孔加至96孔板，37℃吸收2 h進(jìn)行固定。漂洗后每孔加入50 μL血清（以含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶100稀釋，空白對照為不加血清的稀釋液），室溫振蕩孵育1 h。漂洗后每孔加入50 μL羊抗人IgG-AP（含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶5000稀釋），室溫孵育1 h。漂洗后每孔加入100 μL反應(yīng)底物（以ALP緩沖液溶解的2 mg/mL對硝基苯磷酸二鈉溶液），室溫反應(yīng)30 min后馬上測A405值。

1.2.3 CrELISA方法檢測狼瘡性腎炎相關(guān)抗原A1 （TMEM158）、A2（unknown）、B2（PRPF40A）、Q10（CIAO1）的特異性 將導(dǎo)入了陽性抗原pBluescript質(zhì)粒的大腸桿菌XLOLR以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至A600～0.35，加入2 mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)液離心重懸于PBS（pH 7.2，含有0.2 mM蛋白酶抑制劑）中，反復(fù)凍融5～6次后離心取上清，BCA法測其蛋白含量。蛋白裂解液稀釋于包被液 （100mM HEPES，pH 7.2），50 μL/孔加至96孔板，37℃吸收2 h進(jìn)行固定。漂洗后每孔加入50 μL血清 （以含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶100稀釋，空白對照為不加血清的稀釋液），室溫振蕩孵育1 h。漂洗后每孔加入50 μL羊抗人IgG-AP（含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶5000稀釋），室溫孵育1 h。漂洗后每孔加入100 μL反應(yīng)底物（以ALP緩沖液溶解的2mg/mL對硝基苯磷酸二鈉溶液），室溫反應(yīng)30 min后馬上測A405值。

1.3統(tǒng)計方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行該研究數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，運(yùn)用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

目的抗原以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取不同時間段菌體凍融裂解后蛋白，以SDS-PAGE檢測目的蛋白（約為33KDa）誘導(dǎo)表達(dá)情況，可看出誘導(dǎo)4 h時表達(dá)量到達(dá)高峰（圖1）。

圖1　SDS-PAGE檢測目標(biāo)蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)情況（M為marker）

2.2不同抗原濃度包被的結(jié)果

蛋白裂解液稀釋至不同濃度進(jìn)行反應(yīng)，由結(jié)果可以看出40 μg/mL時抗體結(jié)合達(dá)到飽和（表1）。

表1　不同抗原濃度對應(yīng)A405值

2.3 CrELISA結(jié)果分析

t檢驗分析結(jié)果顯示A1、A2在SLE組中的表達(dá)量相對在正常人與NS組中的表達(dá)量更高 （P＜0.05）。A1、A2、B2、Q10在LN組中的表達(dá)量相對在NS組中的表達(dá)量更高（P＜0.05），而與SLE組中的表達(dá)量基本差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2　t檢驗分析各抗原在不同血清中的表達(dá)情況（±s）

表2　t檢驗分析各抗原在不同血清中的表達(dá)情況（±s）

注:表達(dá)情況以A405值（Mean±SD）表示。*1與正常人組和NS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。*2與NS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。*3與正常人組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。

抗原編號　　正常人　SLE　LN　NS A1 A2 B2 Q10 0.47±0.24 0.22±0.10 0.28±0.11 0.26±0.13 （0.67±0.36）*1（0.31±0.18）*1（0.36±0.20）*2（0.32±0.19）*2（0.53±0.27）*2（0.27±0.14）*2（0.28±0.13）*2（0.28±015）e （0.33±0.17）*30.19±0.10 （0.17±0.09）e 0.20±0.10

3　討論

CrELISA（crude lysate ELISA）是由德國的zlem Türeci等提出的一種快速評價多種抗原的高通量研究方法，目的是為SEREX技術(shù)篩選出來的大量抗原的鑒定工作節(jié)省時間，省去繁雜冗長的克隆、表達(dá)和純化，提高鑒定效率。這一方法先通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出SEREX篩選所得的自身抗原并制成蛋白裂解液，再以抗原蛋白作為固相抗原、血清（或處理過的）作為抗體、酶標(biāo)記抗人球蛋白作為二抗進(jìn)行ELISA實(shí)驗。相較于使用純化抗原的標(biāo)準(zhǔn)ELISA法88%的特異性與100%的敏感性，CrELISA法的特異性為100%且敏感性達(dá)到了93%，已足夠適用于基礎(chǔ)實(shí)驗的研究［8］。近年來，CrELISA法已被應(yīng)用于腫瘤抗原的初步鑒定［9］。

在該研究中，對A1（TMEM158）、A2（unknown）、B2（PRPF40A）、Q10（CIAO1）進(jìn)行CrELISA檢測分析，發(fā)現(xiàn)A1、A2在SLE組中的表達(dá)量相對在正常人與NS組中的表達(dá)量更高（P＜0.05），與LN組中的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明4種抗原中，A1、A2的敏感性相對較高，更可能是SLE/LN的特征性自身抗原，有望成為SLE/LN的診斷依據(jù)。A1（TMEM158）是一種跨膜蛋白，基因位于染色體3p21.3，其轉(zhuǎn)錄水平在Ras途徑激活后上調(diào)。已有研究表明TMEM158 在I型、II型及妊娠期糖尿病患者體內(nèi)表達(dá)有上調(diào)趨勢［10］，但在SLE并LN中還是首次顯示出相關(guān)性。A2（unknown）的基因序列經(jīng)過比對沒有找到相似的基因，可能在該文中首次發(fā)現(xiàn)。B2（PRPF40A）是一種前體mRNA加工因子，基因位于染色體2q23.3，據(jù)推測可能參與了細(xì)胞的分裂與遷移等。Q10（CIAO1）屬于WD40家族，基因位于染色體2q11.2。有對酵母CIAO1蛋白的研究認(rèn)為它能與腫瘤抑制蛋白WT1作用［11］，但在人體尚未發(fā)現(xiàn)其與疾病相關(guān)。四種抗原在SLE/LN的發(fā)生與發(fā)展中具體起著什么樣的作用，尚有待于進(jìn)一步的研究揭示。

綜上所述，4種抗原中A1（TMEM158）、A2（unknown）更可能是SLE/LN的特征性自身抗原，有望用于SLE/LN的臨床診斷、大范圍人群血清學(xué)檢測、判斷復(fù)發(fā)及臨床療效檢測等。此外，CrELISA法作為一種快速的高通量研究方法，可應(yīng)用于更多疾病的抗原鑒定，加速疾病的研究進(jìn)程，為了解疾病的生物學(xué)特征及發(fā)病機(jī)制等做貢獻(xiàn)。

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Identification of Four Potential Lupus Nephritis-associated Autoantigens by CrELISA

HU Sang1，2；TAN Jie-wen1，2；QIAO Yu-li1，2；GONG Zu-kang3；HUANG Yu1，2；LIAO Wei-fang1，2；ZHOU Su-fang1，2；CHEN Zhi-jian4；SU Jia-guang5；LIN Wen-zhen1，2
1.Epartment of Biochemistry and Molecular Biology，School of Preclinical Medicine，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi Province，530021 China；2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Biological Molecular Medicine Research，Nanning，Guangxi Province，530021 China；3.Nanning Emergency Medical Center，Nanning，Guangxi Province，530001 China；4.Laboratory Department，the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi Province，530021 China；5.Dermatology Department，the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi Province，530021 China

R593

A

2096-1782（2016）06-0001-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.06.001

本研究由國家自然科學(xué)基金項目（81160263）、廣西自然科學(xué)基金項目（2010GXNSFA013162）。

胡桑（1990-），女，湖南桃江人，碩士，在讀研究生，主要從事狼瘡性腎炎相關(guān)胚胎抗原的篩選和鑒定工作。

林文珍（1972-），女，廣東廉江人，博士，教授，主要從事腫瘤細(xì)胞與分子生物學(xué)研究，E-mail:linwenzhen@msn. com。

2016-02-28）