孕激素受體A型原核表達及單克隆抗體制備

趙小磊　翟晉豫　劉玲玲　梁永波　牛銀銀　李三華　齊　華

(河南省食品藥品審評查驗中心,鄭州450001)

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孕激素受體A型原核表達及單克隆抗體制備

趙小磊翟晉豫①②劉玲玲①梁永波①牛銀銀①李三華①齊華①

(河南省食品藥品審評查驗中心,鄭州450001)

[摘要]目的：制備孕激素受體A型單克隆抗體，為后期應用到免疫組化實驗提供支持。方法：選擇無縫克隆的方法將目的基因與載體連接到一起，通過誘導表達收集蛋白，經過免疫后細胞融合獲得單克隆抗體。將該單克隆抗體經免疫組化驗證。結果：將融合后篩選的陽性細胞制備獲得的單克隆抗體7C7經免疫組化驗證，發現其在乳腺癌、子宮肌瘤組織中呈現陽性，在直腸癌組織、平滑肌組織中呈現陰性，符合目的抗體的要求。結論：該方法獲得的孕激素受體A型單克隆抗體較常規方法周期短，獲得的抗體在不同組織間結果符合預判，對后期研究區別PR-A、PR-B，臨床推廣具有重要意義。

[關鍵詞]孕激素受體；原核表達；單克隆抗體

孕激素受體(Progesterone receptor，PR)作為乳腺癌檢測中經常使用到的一項指標，對治療乳腺癌患者起著重要的指導作用。而在有關治療乳腺癌當中所使用到的內分泌治療方法，常常出現有些PR為陽性，但內分泌療法依然不佳的怪相。針對于此，經Horwitz等[1]研究者的研究發現，PR主要由兩種不同的亞型，即PR-A與PR-B組成。在多位學者大量的研究基礎上[2，3]，揭示出它們的分泌情況往往與乳腺癌的發生、疾病轉移等有著密切的關聯。目前在醫院病理科免疫組化方面應用該不同亞型單克隆抗體已相當普及，但是優秀的抗體多為國外leica、Dako等公司產品，如何準確、快速制備獲得一株優異的PR-A單克隆抗體從經濟、社會層面顯得尤為重要。本研究的重點在于選擇適當的實驗方法，快速、準確的獲得PR-A型單克隆抗體，為后續的研究提供物質支持。

1材料與方法

1.1主要原材料PR cDNA基因購于Origene公司；pET-28a質粒載體、DH5α、BL-21菌株均由河南中醫學院惠贈；無縫克隆試劑盒購于上海近岸生物；PCR引物交由上海生工生物合成；NdeI與XhoI內切酶購于TaKaRa公司；His純化柱、Protein G純化柱為GE公司產品；快免佐劑為北京博奧龍產品；雌性8周齡BALB/c小鼠購于河南省動物實驗中心；SP2/0細胞株由本實驗室保存；PR-A、PR-B免疫組化單克隆抗體為leica公司克隆號分別為：16和SAN27；其他各類化學試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1目的條帶PCR擴增設計PR-A上下游引物，由購買的PR全長基因，截選492～1 443 bp之間的DNA片段，設計上下游引物分別為：5′-GCCTGGTGCCGCGCGGCAGC-CATATG-ATGAGCCGGTCC-GG-3′和5′-GTGGTGGTGGTGGTGGTG-CTCGAG-CTTGCAGGGCGGCGGC-3′。PCR擴增目的條帶，選用的擴增聚合酶為KOD酶，擴增程序：94℃ 7 min預變性，94℃ 30 s變性，55℃退火30 s，68℃延伸60 s，循環次數為30次。PCR結束后經1%核酸凝膠電泳鑒定并切膠回收備用。

1.2.2質粒雙酶切及無縫克隆構建重組質粒將pET-28a依照TaKaRa產品說明書的要求，在Buffer K緩沖液條件下，經NdeⅠ與XhoⅠ內切酶在37 ℃下酶切2 h。后經核酸凝膠電泳回收酶切后質粒備用。將PCR擴增獲得的目的片段與pET-28a雙酶切載體片段按照無縫克隆試劑盒說明書的要求，按照一定比例混合后，加入Buffer與重組酶，在37 ℃下孵育20 min轉入DH5α菌中，后涂含抗生素平板。

1.2.3重組質粒的鑒定與表達純化將1.2.2中挑取菌克隆擴大培養，抽提質粒，利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，同時將出現目的條帶的單克隆菌送測序，判斷有無突變。將抽提質粒轉入BL-21菌感受態細胞中，在IPTG誘導后利用PBS緩沖液超聲破碎，鑒定目的蛋白有無表達，蛋白為可溶性還是包涵體形式。后經過His柱純化，獲得目的蛋白。

1.2.4目的蛋白免疫與效價檢測獲得的目的蛋白，經快免佐劑免疫后，按照50 μg/只劑量注射入小鼠腿部肌肉，經過兩次免疫后檢測小鼠抗體效價水平，評價此免疫效果，融合前選擇最佳的一只小鼠尾部靜脈沖擊加強免疫目的蛋白大約50 μg。

1.2.5細胞融合及抗體篩選與純化首先觀察并收集SP2/0細胞株，經1 200 r/min離心10 min。取小鼠脾臟經研磨器研磨，濾網過濾后離心，除去未完全解離部分。分別計數SP2/0與脾細胞的數目，將兩者按照1∶5的比例進行混合，1 200 r/min離心10 min。在PEG1500誘導劑的誘導下進行融合。融合后按照10萬細胞/孔進行鋪板，在HAT溶液的選擇性篩選作用下，培養細胞生長至孔底約30 %以上。包被目的蛋白(1.2.3中所獲得)200 ng/孔至ELISA微孔板中，4℃過夜。通過ELISA間接法檢測融合后的細胞株，將陽性細胞株克隆化，驗證后培養細胞，將細胞數目按照50萬～200萬/只，注射經石蠟油致敏的小鼠腹腔進行培值，待10～15 d左右采集腹水，經過Protein G柱進行純化，獲得單克隆抗體。

1.2.6單克隆抗體初步鑒定將可能為PR-A的目標性單克隆抗體分別與選取自鄭州大學第一附屬醫院已確定的乳腺癌、子宮肌瘤癌、甲狀腺癌、平滑肌瘤組織，每個組織連續切6張片子，其中3張片子利用leica PR-A抗體(克隆號16)鑒定，同時對照使用自制7C7抗體作為對照，統計結果。經過leica的BondⅢ型自動免疫組化儀進行機器自動免疫組化驗證，獲取的結果進行分析，評價上述制備獲得的單克隆抗體。

2結果

2.1PCR擴增目的條帶及重組質粒的鑒定結果圖1中PCR目的條帶位置正確，并且由圖2可以發現，從DH5α中提取獲得的質粒，經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定發現，在1 000 bp以上位置處出現一條明顯的目的條帶，說明構建重組的質粒正確。

圖1　PCR目的條帶核酸電泳結果Fig.1　Electrophoresis results of PCR(PR)nucleic acid

圖2　PR雙酶切鑒定結果Fig.2　Results of PR double digestionNote: 1.Double digested plasmid vector of pET-28a；2.Double digestion of target band.

2.2測序結果經送至上海生工生物測序基因的反饋結果所示，構建至pET-28a上的PR基因序列492～1 443 bp序列為發現突變位點，同時由測序位點至引物兩端pET-28a序列包含His標簽序列段也正確，可以進行后期蛋白誘導驗證及表達收集工作。

2.3重組蛋白的表達與鑒定重組質粒轉入BL-21菌株中，在IPTG的誘導后，經過His標簽柱純化，純化結果如圖3所示。目的蛋白的大小與理論蛋白大小位置處(35 kD)基本相同。

2.4單克隆抗體純化結果在經過細胞融合獲得的陽性細胞株7C7，注入小鼠腹腔后制備腹水，將腹水經過Protein G柱純化后SDS-PAGE電泳鑒定如圖4所示，結果顯示：純化后的條目的條帶位置分別在大約50 kD與25 kD左右，分子量與小鼠單克隆抗體的分子量相同，目的條帶正確。

2.5單克隆抗體IHC鑒定將純化獲得的單克隆抗體7C7分別與從鄭大一附院獲得的乳腺癌組織(PR-A強陽性、RP-B強陽性)、直腸癌組織、平滑肌瘤組織、子宮肌瘤組織分別進行免疫組化驗證。實驗統計結果如表1所示。選取部分結果圖如圖5所示，從表1、圖5可知，抗體7C7與RP-B組織識別為陰性，與其余呈陰性，與子宮肌瘤呈陽性，說明本抗體基本可以達到診斷使用抗體，后續需進一步驗證。

圖3　重組蛋白純化后鑒定Fig.3　Recombinant protein was identified after purification

圖4　抗體7C7 經Protein G純化SDS-PAGE電泳鑒定結果圖Fig.4　Antibody 7C7 purified by Protein G and electrophoresis results by SDS-PAGE

圖5　7C7抗體各組織免疫組化結果Fig.5　Antibody 7C7 IHC results of organizationsNote: A.PR-A-positive breast cancer；B.PR-B positive；C.Smooth muscle tumors；D.Colorectal cancer；E.Uterine fibroid tissue.

表1各類組織中leica PR-A與7C7比較結果統計

Tab.1Results of statistical that leica PR-A comparison with 7C7 in all kinds of organizations

BreasttissuePR-ABreasttissuePR-BBreasttissuePR(-)ColorectalcancertissueLeiomyomaUterinefibroidtissue1+++----+++Leica2+++----+++3+++----+++4+++----+++7C75+++----+++6+++----+++

3討論

有研究結果結合目前臨床的統計值指出[4]：在浸潤性乳腺癌的患者病例當中，約有一半PR-A、PR-B失去共表達的特點，結果中約有80%以上為PR-A過表達。在正常乳腺組織當中PR-A與PR-B為共表達，在不典型增生、DCIS和多數浸潤性乳腺癌中的PR-A、PR-B均為非共表達。那么，可以揭示出PR-A、PR-B對指導乳腺癌的發生及其類型有著重要意義。同時，因為PR-A的表達與ER呈正相關而PR-B則沒有,在浸潤性導管癌中PR亞型的表達與腫瘤組織學分級相關，但是與淋巴結狀態、腫瘤大小、患者預后無關[5]。因此，制備PR-A單克隆抗體在免疫組化實驗中的應用價值就有著突出重要的意義。

目前受限于免疫組化當中組織樣本預先處理的影響，在免疫組化石蠟組織中，需要對已經變性的抗原進行修復，在制備單克隆抗體的過程當中對于抗原的選擇考慮可以通過原核來進行解決，其蛋白的有關結構特點可能會源自一些保守的蛋白序列位置，基于此考慮，選擇492～1 443 bp堿基處的序列得到的蛋白進行免疫，并制備獲得單克隆抗體。在抗原制備方面，選擇無縫克隆的重組方式，可更快、更高效的獲得重組質粒。并且結合快免佐劑的特點，整個抗體制備周期可以大大縮減。可以降低由購自國外抗體產生的較高成本，為有能力完成上述實驗的實驗室提供借鑒意義。通過結果驗證，發現制備出的PR-A克隆號7C7單克隆抗體不與PR-B存在交叉，且在乳腺癌、子宮肌瘤組織中呈現陽性，在甲狀腺癌組織、平滑肌組織中呈現陰性，符合免疫組化當中評價抗體的原則，受限于獲得樣本的數量有限，后期針對該抗體的親和力、與其他組織的驗證實驗需進一步完善。

參考文獻：

[1]Horwitz KB,Alexander PS.In situ photolinked nuclear progesterone receptors of human breast cancer cells:subunit molecular weights after transformation and translocation[J].Endocrinology,1983,113(6):2195-2201.

[2]黎佩怡，李粉霞，孫敏英,等.廣東漢族女性TAP2基因單核苷酸多態性與散發性乳腺癌相關性研究[J].中國免疫學雜志，2011，27(11)：997-1001.

[3]盧小梅，陳書媛，黃受方，等.乳腺癌石蠟切片中顯示雌、孕激素受體方法和陽性結果判斷標準的探討[J].中華病理學雜志，1996，26(6)：329-331.

[4]Mote PA,Bartow S,Tran N,etal.Loss of co-ordinate expression of progesterone receptors A and B is an early event in breast carcinogenesis[J].Breast Cancer Res Treat,2002,72(2):163-172.

[5]Ariga N,Suzuki T,Moriya T,etal.Progesterone receptor A and B isoforms in the human breast and its disorders[J].Jpn J Cancer Res,2001,92(3):302-308.

[收稿2015-11-30修回2016-04-25]

(編輯許四平)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.018

通訊作者：②E-mail：biozjy@126.com。

作者簡介：趙小磊(1965年-)，女，高級工程師，主要從事醫療器械技術評審、醫療器械注冊核查、醫療器械GMP檢查、藥品GSP認證、藥品注冊核查的工作，E-mail:18638775977@126.com。 通訊作者及指導教師：齊華(1963年-)，男，高級實驗師，主要從事細胞生物學和醫學遺傳學的研究工作，E-mail:qihua63@163.com。

中圖分類號R392.11

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1013-04

Expression of progesterone receptor a protein in prokaryotic and preparation of monoclonal antibodies to PR-A

ZHAO Xiao-Lei,ZHAI Jin-Yu,LIU Ling-Ling,LIANG Yong-Bo,NIU Yin-Yin,LI San-Hua,QI Hua.

Henan Food and Drug Evaluation Identification Center,Zhengzhou 450001,China

[Abstract]Objective:To prepare for mAb of progesterone receptor.It would provide support for the immunohistochemistry behind.Methods: Target gene connected together with a carrier by seamless cloning method.The target protein that expression by inducing was collected.And with cell fusion method ,the monoclonal antibodies were preparation.Then the mAb were detected by IHC.Results: The mAb(clone 7C7)was detected and it found positive for the breast,uterine fibroid tissue,showed negative in colorectal cancer tissue,smooth muscle tissue,the goal of the claim were achieve.Conclusion: Finally,we found the method that prepare for mAb was far beyond our imagination.The result of IHC on different samples about mAb(7C7)obtained compliance with anticipation.Study on the difference between the PR-A and PR-B had significance.

[Key words]Progesterone receptor;Prokaryotic expression;Monoclonal antibody

①河南賽諾特生物技術有限公司，鄭州市病理診斷工程技術研究中心，鄭州450001。