基質金屬蛋白酶-11協同14促進乳腺癌發展①

黃紅顏　譚金祥　任國勝

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科,重慶400016)

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·生物治療·

基質金屬蛋白酶-11協同14促進乳腺癌發展①

黃紅顏②譚金祥任國勝②

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科,重慶400016)

[摘要]目的：檢測基質金屬蛋白酶-11和14(MMP-11和MMP-14)在乳腺癌中的表達，探討MMP-11對乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的影響。 方法：檢測MMP-11和MMP-14在161例浸潤性乳腺癌和10例正常乳腺組織中的表達；運用小干擾RNA(siRNA)將高表達MMP-11的MB-231細胞抑制MMP-11，運用Transwell小室測定其遷移和侵襲力。 結果：MMP-11和MMP-14在161例乳腺癌組織中高表達(分別為122/161及149/161)，兩者均與乳腺癌淋巴結轉移和TNM分期相關，并且MMP-11與MMP-14呈正相關，差異均有統計學意義(P<0.05)；MMP-11被成功干擾后，MB-231細胞中MMP-11和MMP-14表達同時降低，并且細胞遷移、侵襲能力明顯減弱，差異均有統計學意義(P<0.05)。 結論：MMP-11和MMP-14均與乳腺癌侵襲轉移相關，并且MMP-11被抑制后，能下調MMP-14從而抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力，它們可能成為判斷乳腺癌預后的分子標志物及臨床治療靶點之一。

[關鍵詞]基質金屬蛋白酶11/14；乳腺癌；遷移；侵襲

癌癥的發病率和死亡率位居人類疾病前列[1]，而乳腺癌又是廣大婦女常見的惡性腫瘤之一[2]。基質金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinases,MMPs)是降解細胞外基質諸多酶類中較為關鍵的成員之一，越來越多的研究證實MMPs與腫瘤發生發展密切相關，如MMP-2、3、9、11和14等[3-5]，其中MMP-11和MMP-14表達失衡及二者之間的關系是乳腺癌轉移的重要因素之一[6]。本研究旨在檢測MMP-11和MMP-14在乳腺癌中的表達，探討對乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的影響及二者之間的相關性，為臨床醫生判斷乳腺癌生物學行為提供參考指標之一。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料收集重慶醫科大學第一附屬醫院內分泌乳腺外科2012年1月至2015年5月經手術切除但未行新輔助化療的161例浸潤性乳腺癌標本和10例正常乳腺組織標本，均經病理檢查證實。組織標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片。所有患者均為女性，乳腺癌患者年齡為27～79歲，平均年齡為52.6歲。人乳腺癌細胞株MB-231由實驗室購自美國ATCC細胞庫。

1.1.2主要試劑兔抗人MMP-11和MMP-14單克隆抗體購自Abcam公司，免疫組織化學SP系列試劑盒(過氧化物酶標記的鏈霉卵白素檢測試劑盒)、PBS磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)和檸檬酸鈉緩沖液、鼠抗人單克隆抗β肌動蛋白(β-actin)抗體、羊抗兔和兔抗鼠二抗均購自北京中山金橋，MMP-11的特異性siRNA和非特異性siRNA(Negative control，NC)購自廣州銳博，脂質體購自Invitrogen，Transwell小室、6孔板和24孔板均購自美國Corning。

1.2實驗方法

1.2.1免疫組織化學染色檢測MMP-11和MMP-14蛋白的表達：參照SP三步法系列試劑盒說明書操作：組織切片于60℃孵箱2 h，放入二甲苯、酒精常規梯度脫蠟、水化后，置于檸檬酸鈉緩沖液中微波爐高火抗原修復20 min，用3%H2O2去離子水常溫孵育10 min去除內源性過氧化物酶，用山羊血清室溫孵育15 min以封閉，然后分別滴加MMP-11和MMP-14一抗(稀釋比例均為1∶100)，4℃過夜，PBS洗去一抗后分別滴加生物素化二抗工作液及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，分別室溫孵育15 min，PBS洗去二抗，再用DAB顯微鏡下觀察顯色，蘇木素染核。每次實驗均設以PBS代替一抗的陰性對照。

1.2.2MMP-11-siRNA干擾按照脂質體Lip-2000說明書的步驟，將NC、MMP-11-siRNA1、MMP-11-siRNA2及MMP-11-siRNA3瞬時轉染至MMP-11高表達的人乳腺癌細胞株MB-231中，選取干擾效果最好的MMP-11-siRNA1進行MMP-14蛋白表達及細胞功能檢測。

1.2.3Western blot檢測MB-231轉染NC和MMP-11-siRNA1后，MMP-11和MMP-14的表達：向6孔板內加入適量蛋白裂解緩沖液提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，使用微量加樣針將4 μg樣本加在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)中，采用100 V電壓電泳跑膠，90 V電壓轉膜。轉膜后在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，MMP-11和MMP-14單克隆抗體(1∶1 000)為目的，β-actin(1∶1 000)為內參過夜孵育，復溫洗滌后在室溫下用含辣根過氧化物標記的二抗孵育1 h，用化學發光試劑盒Thermo進行Western成像儀曝光成像。

1.2.4Transwell小室實驗測定細胞遷移和侵襲能力：遷移實驗：MB-231轉染NC和MMP-11-siRNA1后，用PBS和無血清培養基先后洗滌兩次，用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整密度為1×105ml-1，在下室(24孔板底部)加入600～800 μl含血清的培養基，上室加入200 μl細胞懸液，放置孵箱培養24 h；用鑷子取出小室，移到4%多聚甲醛室溫固定30 min；移到Giemsa染色液室溫染色10 min；取出小室，輕輕用清水浸泡數次，用棉簽小心擦拭上室底部內側膜表面上的細胞；在顯微鏡下取3個隨機視野照相計數，統計結果。侵襲實驗：Matrigel在4℃過夜融化，用4℃預冷的無血清培養基稀釋Matrigel(1∶8)，冰上操作；在小室上室底部中央垂直加入100 μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4～5 h使其成為膠凍狀，后續步驟同遷移實驗(孵箱培養時間延長至40 h)。

1.2.5切片染色結果判讀選擇背景清晰、陽性定位準確及無非特異性染色的區域進行判讀，判讀標準如下：①陽性細胞百分率(≤5%：0分；5%～25%：1分；25%～50%：2分；>50%：3分)；②細胞染色程度(無：0分；淺黃色：1分；黃褐色：2分；棕黃色：3分)，兩項標準相加：0分為陰性(-)；1～2分為弱陽性(+)；3～4分為中等陽性(++)；5～6分為強陽性(+++)。

1.3統計學處理采用GraphPad Prim5軟件對實驗數據進行統計學分析，計數資料比較采用χ2檢驗，兩組間的相關性采用Pearman相關系數分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1MMP-11和MMP-14在乳腺癌組織中的表達MMP-11和MMP-14在乳腺癌細胞膜及胞質內呈強陽性表達，其陽性表達率分別為75.8%和92.5%，在正常乳腺組織中呈弱陽性甚至不表達，在癌組織及正常組織表達差異均具有統計學意義(P<0.05，圖1)。MMP-11和MMP-14表達均與乳腺癌淋巴結轉移及TNM分期有關(P分別為 0.04、 0.00、 0.01和0.00)，在出現淋巴結轉移、分化程度差、遠處轉移及分期晚的乳腺癌中，MMP-11和MMP-14表達量較高(表1)。MMP-11和MMP-14兩者在乳腺癌組織中的表達呈正相關(相關系數為0.17，P<0.05，表2)。

2.2轉染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231中MMP-11和MMP-14的表達轉染NC、MMP-11-siRNA1后，MMP-11-siRNA1組MB-231中的MMP-11和MMP-14蛋白表達量比NC組明顯減少(圖2)。

2.3轉染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231遷移和侵襲能力的變化通過Transwell小室測定MB-231遷移和侵襲能力。與NC組細胞相比，MMP-11-siRNA1組的MB-231遷移和侵襲能力明顯下降(P<0.01，圖3、4)。

圖1　MMP-11和MMP-14在人乳腺癌組織中的表達Fig.1　Expression of MMP-11 and MMP-14 in breast cancer tissuesNote: A.Normal breast tissue;B.High positive of MMP-11;C.High positive of MMP-14;D.Negative control.

表2MMP-11和MMP-14表達之間的相關性

Tab.2Correlation of MMP-11 and MMP-14

MMP-11-+n-6612MMP-14+33116149n39122P<0.05

Note：P<0.05 is statistically significant.

圖2　MB-231轉染NC、MMP-11-siRNA1后MMP-11和MMP-14蛋白表達Fig.2　After silence of MMP-11 in MB-231 cell,expression of MMP-11 and MMP-14Note: 1.NC;2.MMP-11-siRNA1.

圖3　轉染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231遷移能力Fig.3　After silence of MMP-11 in MB-231 cell,migration of MB-231Note: A.NC;B.MMP-11-siRNA1.

表1MMP-11和MMP-14的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

Tab.1Correlation of MMP-11 and MMP-14 protein expression with clinicopathological characteristics in breast cancer

CharacteristicsnMMP-11-++++++χ2PMMP-14-++++++χ2PMenopause8.950.032.090.55Premenopausal78162227135101251Postmenopausal832392922761060Tumorsize6.440.091.840.61≤3cm622111219471140>3cm9918203526891171Lymphnodemetastasis8.590.03518.440.0004Yes91192026262102069No702011309106252Histologicalgrade4.500.219.060.0286Ⅰ6819162310681539Ⅱ/Ⅲ932015332568772TNMstage12.340.00623.580.0001Ⅰ6016519209121029Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ10123263715341282

Note：P<0.05 is statistically significant.

圖4　轉染NC、MMP-11-siRNA1后，MB-231侵襲能力Fig.4　After silence of MMP-11 in MB-231 cell,invasion of MB-231Note: A.NC;B.MMP-11-siRNA1.

3討論

目前在人類發現有23種MMPs(Degradome database;http://degradome.uniovi.es)家族成員，近年來，眾多學者發現有多種MMPs成員與腫瘤惡性行為密切相關，其中較為顯著的為MMP-11和MMP-14，二者在腫瘤發展中的作用越來越受到廣大學者重視[3,7]。我們前期研究發現：MMP-11不僅在乳腺形態發生和分化中扮演重要角色，還通過誘導一系列分子過程而調控上皮細胞的生物學行為[8]。有研究顯示：MMP-11在乳腺癌的表達與乳腺癌淋巴結轉移狀態和TNM分期有關，并促進三陰性乳腺癌的侵襲和轉移[9，10]。MMP-14及其抑制劑在乳腺腫瘤血管生成中起著關鍵性作用[11]，一篇meta分析顯示：MMP-11和MMP-14在乳腺癌中高表達與患者不良預后相關[12]。

我們研究發現MMP-11和MMP-14在乳腺癌中呈普遍高表達，同時與乳腺癌淋巴結轉移狀態及TNM分期相關，而且在乳腺癌組織中兩者之間存在正相關。在干擾MMP-11后，乳腺癌細胞株MB-231的遷移及侵襲明顯降低，同時MMP-14表達也明顯降低，由此我們認為：在乳腺癌細胞中抑制MMP-11后，MMP-14的表達亦被抑制，從而大大減弱了乳腺癌細胞的遷移和侵襲；相反，MMP-11自身促進乳腺癌遷移侵襲的同時，或許協同MMP-14促進乳腺癌的發展。而有研究報道顯示：MMP-11作為MMP-14的作用底物被剪切成許多小的片段游離于細胞質內，MMP-14對MMP-11進行負向調控而使其喪失活性[13]。由此我們推測：MMPs家族成員之間也許相互影響而促進乳腺癌的生物學進程，而它們之間詳細的作用機制有待廣大科研工作者進一步揭示。

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[收稿2016-02-22修回2016-04-25]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.014

作者簡介：黃紅顏(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事乳腺癌發展機制的研究，E-mail:huangyrc320@163.com。 通訊作者及指導教師：譚金祥(1976年-)，男，博士，副教授，主要從事乳腺癌轉移機制的研究，E-mail:tjx1202@163.com。 任國勝(1958年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事乳腺癌發生發展機制的研究，E-mail:rgs726@163.com。

中圖分類號R73

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0996-04

Matrix metalloproteinases-11 collabrotive matrix metalloproteinases-14 promote development of breast carcinoma

HUANG Hong-Yan,TAN Jin-Xiang,REN Guo-Sheng.

Department of Endocrine and Breast Surgery,Chongqing Key Laboratory of Molecular Oncology and Epigenetics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression pattern of MMP-11 and MMP-14 in breast carcinoma,and the effect of MMP-11 on breast carcinoma cell migration and invasion.Methods: MMP-11 and MMP-14 expression were examined in 161 invasive breast carcinoma tissue samples and 10 normal breast tissue samples.siRNA was used to knockout MMP-11 in breast carcinoma cell line MB-231 and Transwells were used to evaluate changes in migration ability and invasion ability.Results: Both MMP-11 and MMP-14 were highly expressed in breast carcinoma samples,122 and 149 samples out of 161,respectively.The expression of both proteins were correlated with lymph node metastasis and TNM staging.After knockout of MMP-11,the expression of both proteins decreased in MB-231 cell line and experiments show that the cell′s migration and invasion abilities were significantly weakened.Conclusion: MMP-11 and MMP-14 could promote invasion and metastasis of breast carcinoma.Knockout of MMP-11 results in the downregulated expression of MMP-14,and the inhibition of breast carcinoma cell′s migration and invasion.They could be potential prognostic markers and treatment targets for of breast carcinoma.

[Key words]Matrix metalloproteinase-11 and 14; Breast carcinoma;Migration;Invasion

①本文受國家自然科學基金(81102008)資助。

②同時供職于重慶醫科大學附屬第一醫院分子腫瘤及表觀遺傳學重慶市重點實驗室，重慶400016。