PLTP在香煙誘導HBECs合成IL-8中的作用①

余秀英　黎友倫　巫鳳蘋　陳亞娟

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸科，重慶400016)

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PLTP在香煙誘導HBECs合成IL-8中的作用①

余秀英黎友倫巫鳳蘋陳亞娟

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸科，重慶400016)

[摘要]目的：研究磷脂轉運蛋白(PLTP)對香煙誘導人支氣管上皮細胞(HBECs)合成白介素8(IL- 8)的影響。方法：Wistar大鼠連續3 d被動吸煙，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，蘇木精-伊紅(HE)染色，免疫組織化學法(IHC)檢測蛋白表達；體外培養HBECs，不同濃度煙草提取物(CSE)刺激；PLTP siRNA干擾后，進行CSE刺激。MTT法檢測細胞增殖，同時檢測IL-8含量及PLTP表達。結果：煙熏組BALF白細胞計數以及分類計數較對照組均明顯升高(P<0.01)，IHC顯示煙熏組PLTP和IL-8蛋白表達高于對照組；高濃度CSE(2%、4%)抑制HBECs增殖(P<0.001)；不同濃度的CSE作用24 h后，IL-8 mRNA及蛋白表達量增加,而PLTP蛋白表達量下降，并且IL-8蛋白分泌呈現時間依賴性；PLTP siRNA處理后，IL-8表達量明顯升高(P<0.001)。結論：PLTP基因缺失促進香煙誘導HBECs合成IL-8。

[關鍵詞]煙草煙霧提取物; 人支氣管上皮細胞; 磷脂轉運蛋白; 白介素8

吸煙可以導致正常肺及氣道結構的破壞，引起肺部嚴重疾患，如肺損傷、慢性阻塞性肺病、肺癌等。氣道上皮作為抵御煙草煙霧的第一道屏障，香煙中的固有成分及在燃燒所產生的有毒物質可以致其嚴重的炎癥反應[1]。Aggarwal等[2]研究證實,中性粒細胞激活在肺損傷的發病機制中起著關鍵性的作用。而中性粒細胞趨化因子IL-8可以趨化和激活中性粒細胞[3]。研究表明，肺上皮細胞是IL-8的重要來源[4]。

磷脂轉運蛋白(Phospholipid transfer protein，PLTP)廣泛表達于人和動物的血漿和組織中，主要促進血漿脂蛋白，脂蛋白與細胞間脂質及相關物質轉運與交換。近年來PLTP逐漸成為非特異性免疫反應領域中的研究熱點[5-7]。文獻報道，正常人類和鼠的肺組織是PLTP mRNA表達最為豐富的器官[8]，Brehm等[9]研究發現吸煙可以上調肺組織PLTP的表達活性，我們的前期研究證實[10]，煙草提取物可以刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞和A549細胞合成PLTP。因此，本文利用支氣管上皮細胞，借此研究煙草刺激支氣管上皮細胞合成PLTP蛋白的影響以及特異性基因敲除的方法研究PLTP在香煙煙霧誘導HBE細胞合成白介素8(interleukin-8，IL- 8)中的作用，以進一步探討PLTP參與香煙煙霧所致肺損傷的發病機制。

1材料與方法

1.1藥物、試劑和儀器高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Thermo公司，SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術研究所；IL-8、PLTP抗體購于美國Abcam公司，GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購于Santa公司；IL-8 ELISA KIT購自博士德公司；RNAiso Plus試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green Supermix均購自TaKaRa公司，PLTP siRNA(sense：5′-GAGCUGCAACUGAC-AUCUUTT-3′；antisense:5′-AAGAUGUCAGUUGCA-GCUCTG-3′)購自吉瑪基因，引物：PLTP (5′- TCTGCCCTGTCCTCTACCAC-3′;5′-GGCTCCAGTTCCT-CTCAGTC-3′),IL-8(5′-TTCAGAGACAGCAGAG-CACA-3′;5′-AGCACTCCTTGGCAAAACTG-3′)購于上海生物工程公司，其余均為國產試劑。宏升牌香煙購自重慶煙草公司，每只煙含焦油11 mg，一氧化碳17 mg，尼古丁1.1 mg。CO2恒溫培養箱，美國Thermo Scientific公司；超低溫冰箱，美國Revco公司；高速臺式離心機，美國Sigma公司；純水儀，美國Milipore公司；M450酶標儀，實時定量PCR儀，美國Bio-Rad公司； PAC3000型電泳儀、電轉儀，北京六一公司。

1.2方法

1.2.1Wistar大鼠吸煙模型的建立以及BALF白細胞計數和肺組織切片HE染色及ICH法檢測PLTP、IL-8的表達20只清潔級雄性Wistar大鼠，體重(180±10)g，購自重慶醫科大學實驗動物中心。將20只Wistar大鼠隨機分為2組：正常對照組和煙熏組。將兩組大鼠分別放入相同大小特制的煙熏箱中，正常對照組暴露于空氣中，而煙熏組則進行被動吸煙，6次/d，每次持續燃燒香煙(2支/3支循環進行)60 min，每次之間間隔至少15 min，共3 d[11]。

最后一次香煙暴露18 h后處理各組Wistar大鼠。各組大鼠采用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈放血處死大鼠，結扎左側肺門，分離出頸部氣管，采用外徑約1.8 mm的靜脈導管進行氣管插管，然后注入預熱生理鹽水(37℃)3 ml,輕輕按摩右肺組織并上下顛倒大鼠后，緩慢回抽灌洗液，然后再將所得液體緩慢注回肺內并重復4次，保證回收率75%以上。BALF加入同體積的70%乙醇，交于實驗室進行白細胞人工計數和分類計數。留取左側肺組織，10%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色后，光學顯微鏡觀察進行病理學分析。采用SP法進行IHC法檢測肺組織PLTP和IL-8的表達。

1.2.2細胞株來源、培養以及煙草煙霧提取物的制備人支氣管上皮細胞(Human bronchial epithelial cells,HBECs)源自重慶醫科大學生命科學院實驗室，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規培養，每 2～3 d傳代1次，所有實驗均在細胞對數生長期進行。

煙草煙霧提取物制備操作步驟如下所述：點燃香煙，去除濾嘴，安放在抽吸裝置上。勻速地抽吸，使煙霧通過一個裝有10 ml無血清的DMEM培養基的玻璃瓶，此時可見煙草煙霧通過DMEM培養基并產生大小均勻的氣泡，收集瓶中出現大量煙霧，且保證每支香煙燃燒約4 min。當10支香煙燃燒產生的煙霧通過該培養基后，停止抽吸。調節香煙煙霧-DMEM培養基混合物的pH至7.4，并用0.22 μm的過濾器除去雜質和細菌，即為煙草煙霧提取物。使用Beckman DU 640 分光計(Fullerton,CA,USA)測定煙草煙霧提取物在320nm處的吸光度值，約為1.36±0.12，將此時對應的CSE濃度設為100%。實驗時，根據實驗需要將100%煙草煙霧提取物稀釋至所需濃度即可[10]。

1.2.3MTT法檢測CSE對HBE細胞增殖的影響將約2×103/0.2 ml細胞種植在96孔板內，培養24 h，然后加入相應濃度的CSE繼續培養24 h后，吸盡孔板內的培養液，用PBS清洗兩次后再在每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT和100 μl培養液混勻，在37℃、5%CO2培養4 h，吸干每孔內的上清，每孔加入DMSO 150 μl震蕩使沉淀充分溶解，酶標儀570 nm波長測定OD值。

1.2.4實時定量PCR(RT-PCR)檢測IL-8 mRNA的表達取處于對數生長期的人支氣管上皮細胞HBE以2×105ml-1的密度接種于6孔板中，分別設置對照組和實驗組，常規培養24 h后實驗組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1%CSE處理24 h后收集細胞采用Trizol法分別提取各細胞內的總RNA，經核酸濃度測定儀(Fullerton,CA,USA)測定RNA的濃度，并且樣品A260/280比值均介于1.8～2.0。使用TaKaRa逆轉錄試劑盒采用兩步法將樣品逆轉為cDNA，然后在PCR儀(Bio-Rad,USA)上進行實時定量PCR測定IL-8 mRNA的表達量。

1.2.5蛋白質印跡法(Western blot)檢測PLTP、GAPDH蛋白的表達取處于對數生長期的人支氣管上皮細胞HBE以2×105ml-1的密度接種于6孔板中，分別設置對照組和實驗組，常規培養24 h后實驗組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1%CSE處理24 h，收集上清液，然后將其置于離心機中4℃，3 000 r/min離心15 min后收集上層液體于-80℃冰箱中保存。收集細胞提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。運用酶標儀測定各組蛋白質含量并配平，使各組蛋白終濃度一致。每個點樣孔加樣60 μg蛋白樣品液，電泳、轉膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，采用兔抗人PLTP (1∶3 000),兔抗人內參GAPDH多抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。加入二抗(1∶1 000)常溫孵育2 h。TBST溶液漂洗,用ECL試劑發光，曝光。圖像掃描后運用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的吸光度值，將對照組和實驗組的目的條帶的灰度值和內參的吸光度值比值表示蛋白質相對表達水平。

1.2.6酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)測定IL-8相對含量將收集的上清液稀釋十倍之后按每孔100 μl加入事先準備好的ELISA試劑盒孔板中37℃孵育90 min，棄液后每孔加入生物素抗人IL-8抗體工作液100 μl 37℃反應60 min，用PBS洗滌3次后每孔加入ABC工作液100 μl 37℃反應30 min，再次用PBS洗滌5次后每孔按90 μl依次加入TMB顯色液，37℃避光反應30 min后每孔加入100 μl TMB終止液。用酶標儀在450 nm測定OD值。根據所測OD值作出標準曲線，然后計算IL-8蛋白表達量。

1.2.7陽離子脂質體法轉染siRNA取處于對數生長期的人支氣管上皮細胞HBE以2×105ml-1的密度接種于6孔板中，分別設置陰性對照組和實驗組常規培養16～24 h，細胞貼壁生長50%左右時，準備轉染；DEPC消毒的去酶EP管中加入250 μl Opti-MEM培養液及5 μl RNAiMAX轉染試劑，混勻，室溫孵育5 min，另取DEPC消毒的去酶EP管加入250 μl Opti-MEM培養液及60 pmol的siRNA,混勻; 5 min之后將RNAiMAX混合試劑和siRNA混合試劑混合，混勻，室溫靜置20 min后按照分組加入事先用PBS清洗過的孔板中，再加入不含胎牛血清的培養基，總體積為2 ml；37℃孵育6 h后，吸取培養基，加入完全培養基孵育18～24 h后，再將HBE細胞設置為NC siRNA處理組、CSE+NC siRNA處理組、siPLTP處理組、CSE+siPLTP處理組處理24 h之后收取上清液用ELISA法測定IL-8相對含量，提取各組細胞RNA以及總蛋白，分別用RT-PCR測定PLTP、IL-8 mRNA的表達情況以及用Western blot檢測PLTP蛋白的表達量。

2結果

2.1香煙暴露后大鼠肺組織組織學觀察、IHC分析以及BALF白細胞計數情況如圖1A所示，3 d香煙暴露之后煙熏組肺組織充血水腫；如圖1B所示，HE染色顯示正常肺組織肺泡結構完整正常，無炎癥細胞浸潤，煙熏組血管腔充血，肺間質炎癥細胞浸潤，肺泡腔擴大斷裂，肺泡融合；IHC結果顯示，與對照組比較，煙熏組肺上皮細胞PLTP(如圖1C所示)和IL-8(如圖1D所示)表達升高；如圖E所示，BALF中，煙熏組白細胞總數顯著高于對照組，并且中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞均顯著高于對照組。

圖1　香煙導致大鼠肺損傷Fig.1　Cigarette smoke caused lung injury in ratsNote: A.Lung was photographed to detect changes; B.HE staining was performed to detect pathological changes(HE,×400);C.Expression of PLTP was detected by IHC(IHC,×400);D.Expression of IL-8 was detected by IHC(IHC,×400).E.Total and differential white blood cell counts in BALF.**.P<0.01 vs control group；***.P<0.001 vs control group.

2.2煙草煙霧提取物對人支氣管上皮細胞HBE合成IL-8的影響如圖2A所示，經不同濃度(0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%、4%)的煙草煙霧提取物作用于HBE細胞，采用MTT法，測煙草提取物對HBE細胞增殖情況的影響，我們發現0.125%、0.25%、0.5%、1%濃度的煙草提取物對HBE細胞增殖無明顯影響，而2%和4%濃度的煙草提取物可以抑制HBE細胞增殖并且促進其死亡；如圖2B、C、D所示，經不同濃度(0.25%、0.5%、1%)和不同時間(6、12、24 h)的煙草煙霧提取物作用于HBE細胞，IL-8表達隨著煙草濃度的增加而增加，并且在24 h分泌達到明顯升高，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，煙草煙霧提取物能夠刺激HBE細胞合成和分泌IL-8，并且呈現濃度依賴性和時間依賴性。

2.3煙草煙霧提取物對人支氣管上皮細胞HBE合成PLTP的影響如圖3所示，經不同濃度的煙草煙霧提取物作用于HBE細胞24 h，PLTP的表達隨著煙草濃度升高而下降，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，煙草煙霧提取物能夠抑制HBE細胞合成PLTP,而PLTP與IL-8是否存在內在聯系，尚需論證。

圖2　煙草提取物對HBECs釋放IL-8的影響Fig.2　Effects of CSE on expression of IL-8 in HBECsNote: A.Effects of CSE on cell growth by MTT;B.IL-8 mRNA expression was detected by RT-PCR;C，D.Protein expression of IL-8 was detected by ELISA.*.P<0.05 vs control group;**.P<0.01 vs control group；***.P<0.001 vs control group.

2.4PLTP轉染效率以及在正常情況下和煙草煙霧刺激下其對IL-8 mRNA表達的影響如圖4所示，PLTP siRNA轉染穩定48 h ，PLTP siRNA的基因沉默率達到70%，并且觀察到PLTP基因沉默之后，IL-8 mRNA的表達反而升高，并且PLTP siRNA沉默之后促進煙草提取物刺激HBE細胞IL-8 mRNA的表達。

2.5PLTP基因沉默對煙草煙霧提取物誘導的人支氣管上皮HBE細胞PLTP以及IL-8蛋白表達的影響如圖5所示，1%的煙草提取物濃度作為工作濃度，PLTP siRNA預處理后，加入煙草提取物共培養24 h，PLTP基因沉默之后可以促進煙草提取物刺激后IL-8蛋白的釋放。

圖3　WB檢測PLTP蛋白表達量Fig.3　Effect of CSE on expression of PLTP in HBECsNote: *.P<0.05 vs control group;***.P<0.001 vs control group.

圖4　RT-PCR檢測轉染效率Fig.4　Infection efficiency detected by RT-PCRNote: A.Infection efficiency detected by RT-PCR;B.PLTP mRNA and IL-8 mRNA expression detected by RT-PCR.**.P<0.01 vs NC siRNA group；***.P<0.001 vs NC siRNA group；###.P<0.001 vs NC siRNA+CSE group.

圖5　PLTP 及IL-8 表達情況Fig.5　Protein expression of PLTP and IL-8 in each groupsNote: A.Protein expression of PLTP was detected by Western blott;B.Protein expression of IL-8 was detected by ELISA.***.P<0.001 vs NC siRNA group；##.P<0.01 vs NC siRNA+CSE group.

3討論

煙草煙霧中含有大量自由基(ROS)和有毒物質，吸入人體可導致細胞癌變、氣道損傷以及肺部炎癥。有研究報道，不管是小鼠吸煙模型還是細胞離體實驗中，IL-8表達升高幅度均比其他炎癥因子高[12,13]。并且IL-8在煙草煙霧導致的肺損傷中起著重要作用，它可以趨化和激活中性粒細胞，導致其在肺部的浸潤。Modelska等[14]研究發現,抗IL-8預處理可阻斷中性粒細胞的肺部浸潤,顯著降低鹽酸、內毒素等對血管內皮和肺泡上皮細胞的損傷。

PLTP的主要功能是參與低密度脂蛋白與高密度脂蛋白間的磷脂轉運,修飾HDL分子大小及脂質組成。隨著研究的不斷深入，發現其水平及活性與多種炎癥參與性疾病相關。我們前期的研究發現煙草提取物刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞可以引起PLTP顯著升高，因此我們此次研究的目的主要是探索吸煙引起的炎癥反應與PLTP的關系。

我們的研究發現，在大鼠吸煙模型中，煙熏組白細胞總數、中性粒細胞、PLTP以及IL-8蛋白表達均高于對照組(如圖1所示)，在離體細胞實驗中，PLTP以及IL-8的表達量具有煙草濃度依賴性，隨著煙草濃度的升高，合成IL-8的量也不斷增加(如圖2B～D)，然而，PLTP卻隨著煙草濃度的增加而表達下降(如圖3)，而通過PLTP基因沉默發現IL-8不管是在基礎水平還是在煙草煙霧誘導情況下均顯著升高(如圖4、5所示)，我們的研究結果表明PLTP具有抗炎作用，煙草煙霧引起PLTP下降，抗炎作用減弱，加劇IL-8的合成和釋放。然而，PLTP在煙草煙霧誘導HBE細胞中合成減少卻與Brehm等[9]研究以及我們前期的研究[10]、煙熏大鼠模型IHC染色截然相反，這是否與細胞類型有關？是否是因為PLTP在肺泡Ⅱ型上皮細胞中的作用有關？Jiang等[8]認為PLTP可以運輸肺泡表面活性物質，由于吸煙引起肺泡表面的活性物質顯著減少，肺泡Ⅱ型上皮細胞代償增生，這種改變刺激PLTP合成增加，以運輸更多的表面活性物質到達肺泡表面來緩解肺氣腫的病理改變。然而，支氣管上皮細胞沒有合成肺泡表面活性物質的能力，HBECs合成的PLTP僅僅作為細胞的表面成分，而未參與運輸肺泡表面活性物質，因此在煙草刺激HBECs導致細胞損傷時PLTP合成減少。有研究報道，在嚴重的內毒素血癥小鼠模型中，與野生型小鼠相比，PLTP-/-小鼠的血漿以及組織中炎癥因子水平更高[15]，將其分離得到的脾細胞在暴露于脂多糖(LPS)中，其炎癥反應比野生型的更為劇烈，并且脾細胞死亡率也顯著升高。Brehm等[9]研究也表明，PLTP基因沉默小鼠在脂多糖誘導肺損傷模型中，IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MMP-9較對照組顯著升高，而相較未處理組，PLTP處理可以抑制IFN-γ、TNF-α、IL-1β、MMP-9的釋放。這些研究結果與我們結果一致，表明PLTP有一定的抗炎作用。然而Schlitt等[16]的研究卻發現，在動脈粥樣硬化小鼠模型中，PLTP-/-小鼠通過下調白介素6(IL-6)達到抗炎作用，這與我們的實驗結果相反，可能原因有二，其一是模型的不同，再者就是所測的炎癥因子不同，提示PLTP在調節炎癥介質表達中作用機制復雜，有待進一步深入研究。

綜上所述，我們證實PLTP基因沉默后，香煙誘導人支氣管上皮細胞合成和釋炎癥因子IL-8增加，表明PLTP基因具有一定的抗炎作用。通過此實驗，可以為研究煙草煙霧所致的肺部急性炎癥疾病致病機制提供思路和參考。

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[收稿2015-10-20修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.004

作者簡介：余秀英(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統疾病發病機制方面的研究，E-mail：405426832@qq.com。 通訊作者及指導教師：陳亞娟(1980年-)，女，博士，講師，主治醫師，主要從事呼吸系統小氣道疾病發病機制方面研究，E-mail:yajuanchencqmu@sina.com。

中圖分類號R563.19

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0952-06

Effect of PLTP on CSE-induced IL-8 production in human bronchial epithelial cells

YU Xiu-Ying,LI You-Lun,WU Feng-Ping,CHEN Ya-Juan.

Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University，Chongqing 400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of PLTP gene on CSE-induced IL-8 production in human bronchial epithelial cell line (HBECs).Methods: Wistar rats were exposed to air or cigarette smoke for 6 hours/day on 3 consecutive days,then the lungs were sectioned and examined.The number of total white blood cell and differential white blood cells in BALF were counted.The different concentrations of CSE co-cultured with HBECs for 24 hours.Cells growth was detected by MTT assay.Expression levels of PLTP mRNA and IL-8 mRNA were examined by RT-PCR,protein of PLTP was investigated by Western blot,and production of IL-8 examined by ELISA.Results: The number of white blood cells in BALF was significantly increased compared with controls.Enhanced expression level of PLTP and IL-8 were observed in CS-exposure group.Proliferation of HBECs tends to decrease at high concentrations of CSE(2.0% CSE and 4.0% CSE).The results suggested that the production of IL-8 induced by CSE in a time- and concentration-dependent manner,while the expression of PLTP induced by CSE in a dose-dependent manner.Furthermore,expression levels of IL-8 significantly increased after silence PLTP gene. Conclusion: PLTP siRNA could increase CSE-induced IL-8 production in HBECs.

[Key words]Cigarette smoke extract;Human bronchial epithelial cells; HBECs; PLTP; IL-8

①本文為國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81200009)、國家臨床重點專科專項資助(衛辦醫政函[2012]649號)和重慶市衛生局中醫藥研究課題(ZY20132165)。