金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因的檢測(cè)

吳建國(guó)， 黃余清， 嚴(yán)　明， 劉成偉， 黃文祥， 賈 蓓

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金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因的檢測(cè)

吳建國(guó)1， 黃余清1， 嚴(yán)明2， 劉成偉2， 黃文祥2， 賈 蓓2

摘要:目的 對(duì)金黃色葡萄球菌（金葡萄）的耐消毒劑基因qacA/B進(jìn)行檢測(cè)分析。方法 收集重慶市奉節(jié)縣人民醫(yī)院2014年1—12月住院患者中分離的金葡菌51株，采用藥敏試驗(yàn)、PCR技術(shù)進(jìn)行mecA和qacA/B檢測(cè)，篩選出的攜帶有qacA/B基因的金葡菌進(jìn)行spa分型，并分析相應(yīng)的臨床情況和對(duì)16種抗菌藥物的耐藥模式。結(jié)果 金葡菌中mecA和qacA/ B檢測(cè)率分別為21.6%（11/51）和13.7%（7/51）；耐甲氧西林金葡菌（MRSA）菌株中qacA/B陽(yáng)性率為54.5%（6/11），甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）菌株中qacA/B陽(yáng)性率為2.5%（1/40），陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。7株qacA/B經(jīng)spa分型發(fā)現(xiàn)4個(gè)型，分別為t037、t091、t932、t895，其中t037有4株來(lái)源于兒科病房，其余菌株各1株，以t037型別為主。結(jié)論 該院分離出攜帶耐消毒劑qacA/B基因的金葡菌，MRSA攜帶率明顯高于MSSA，并且可能至少存在1個(gè)來(lái)自院內(nèi)的克隆株在兒科病房流行。

關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌； 耐消毒劑基因； qacA/B； mecA； spa分型

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA），因其嚴(yán)重的多重耐藥，而引起當(dāng)今世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。由于消毒劑大量使用，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)消毒劑的敏感性下降［1-2］。與抗菌藥物耐藥菌株一樣，抗消毒劑菌株的出現(xiàn)可能導(dǎo)致醫(yī)院消毒的失敗，可能引起醫(yī)院內(nèi)耐藥菌如MRSA感染的流行和傳播。金葡菌耐消毒劑基因的種類至少有12種如（qacA～qacJ， smr， 及norA）［3-8］，對(duì)消毒劑的耐藥與細(xì)菌攜帶qacA/B密切相關(guān)，尤其在MRSA菌株中廣泛流行［9-12］。奉節(jié)縣人民醫(yī)院為地處重慶市偏遠(yuǎn)山區(qū)的縣級(jí)二甲醫(yī)院，本研究通過(guò)對(duì)我院2014 年1—12月分離的51株金葡菌進(jìn)行mecA和耐消毒劑qacA/B基因的檢測(cè)，并進(jìn)行spa分型和耐藥模式分析，以了解該基因在我院MRSA和金葡菌甲氧西林敏感株（MSSA）中的流行情況，有利于對(duì)金葡菌所致醫(yī)院感染的控制。

1　材料與方法

1.1材料

收集奉節(jié)縣人民醫(yī)院2014年1—12月臨床各科室分離的金葡菌51株，標(biāo)本分別來(lái)自于痰液、傷口分泌物、膿液、血液等。使用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的葡萄球菌和微球菌鑒定系統(tǒng)API STAPH，以及乳膠凝集法快速檢測(cè)金葡菌試劑Slidex Staph Plus對(duì)所收集的菌株進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC25923、ATCC29213、ATCC43300，qacA/B陽(yáng)性菌株TS77。

1.2方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用紙片法或稀釋法測(cè)定MIC，以2014年CLSI［13］評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)51株細(xì)菌對(duì)16種抗菌藥物以及4種消毒劑的藥敏。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取及模板制備 取MH平皿上新鮮過(guò)夜單個(gè)菌落2～3個(gè)，混懸于濃度為10 g/ mL溶菌酶的50 μL滅菌TE液中 （pH=8.0），37℃水浴1 h，100℃煮沸10 min，14 000 r/min離心10 min后取上清液即含細(xì)菌DNA。

1.2.3 mecA基因擴(kuò)增 mecA引物參照J(rèn)ONAS等［14］設(shè)計(jì)，上游引物 P1：5'-AAAAT-CGATGGTAAAGGTTGGG-3'（22 bp）；下游引物P2：5'-AGTTCTGCAGTACCG GATTTGC-3'（22 bp）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，MgCl23 μL，dNTP4 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌蒸餾水加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物樣品在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠電泳成像并保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將結(jié)果與GenBank中提供的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 qacA/B基因擴(kuò)增 qacA引物根據(jù)Pubmed基因庫(kù)中公布的基因序列用primer 5.0設(shè)計(jì)：上游引物 P1：5'-GCTGCATTTATGACAATGTT-TG-3' （22 bp）；下游引物P2：5'-AATCCCACCTACTAAAGCAG-3'（20 bp）。

1.2.5 spa分型 對(duì)16株qacA陽(yáng)性的金葡菌進(jìn)行spa分型，spa分型引物參照參考文獻(xiàn)［15-16］：上游引物 P1：5'-GACGATCCTTCAGTGAGCAAAG-3’（22 bp）；下游引物P2：5'-GCAGCAATTTTGTCGGCAGTAG -3'（20 bp）。10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，MgCl23 μL，dNTP 4 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌蒸餾水加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30次循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min， 4 ℃保存。取5 μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物樣品加入1.5%瓊脂糖凝膠加樣孔中，在1×TBE中，電壓110 V，時(shí)間25 min，紫外凝膠電泳成像并保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果的重復(fù)編碼判讀參照文獻(xiàn)［17］，并通過(guò)spa分型的數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// www.ridom.de/spaserver）進(jìn)行分型。

2　 結(jié)果

2.1基因的檢測(cè)

表明mecA的攜帶率為21.6%（11/51），部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 MIC測(cè)定

圖1　mecA基因電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of the PCR products for mecA gene

7株攜帶有qacA/B基因的金葡菌和參考菌株對(duì)4種常用消毒劑和頭孢西丁的藥敏試驗(yàn)見(jiàn)表1。

2.3基因在金葡菌中的檢出率

金葡菌中qacA/B檢測(cè)陽(yáng)性率為13.7%（7/51）；MRSA菌株中qacA/B陽(yáng)性率為54.5%（6/11），MSSA菌株中qacA/B陽(yáng)性率為2.5%（1/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在7株qacA/B陽(yáng)性菌株中6株為MRSA，1株為MSSA，陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher精確概率法，P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.4spa 分型

7株攜帶有qacA/B的金葡菌的spa分型電泳圖見(jiàn)圖3。如表2所示，可見(jiàn)spa基因重復(fù)序列數(shù)為6～10個(gè)。將測(cè)序結(jié)果提交spa重復(fù)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分別定為t037、t091、t932、t895，其中t037有4株，其余菌株各1株，以t037型別為主，占的4/7。

2.5細(xì)菌分布

分析了7株攜帶qacA/B基因金葡菌患者的臨床資料顯示，感染均來(lái)自于醫(yī)院內(nèi)，科室分布以兒科為主，標(biāo)本來(lái)源為痰，呼吸道感染傳播為主，見(jiàn)表3。

2.6耐藥模式

7株qacA/B陽(yáng)性菌株對(duì)16種常用抗金葡菌藥物的耐藥表型進(jìn)行分型，其中507、509、511和520均為A型，534、551和557分別為B、C、D 型。A型的菌株表現(xiàn)為對(duì)氨芐西林-舒巴坦、氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、磷霉素、夫西地酸、慶大霉素、亞胺培南、莫西沙星、四環(huán)素耐藥，對(duì)利奈唑胺、利福平、替考拉寧和奎奴普丁-達(dá)福普汀敏感，B型則除了對(duì)氯霉素、紅霉素和四環(huán)素耐藥外對(duì)其他檢測(cè)抗菌藥物均敏感，而C型和D型除了對(duì)磷霉素和莫西沙星敏感性不一致外其余都耐藥［10］，見(jiàn)表4。

表1　7株qacA/B陽(yáng)性株和參考菌株mecA檢出率及對(duì)4種消毒劑及頭孢西丁的MICTable 1 The susceptibility of 7 qacA-positive S. aureus strains and 2 reference strains to 4 disinfectants and cefoxitin in terms of minimum inhibitory concentrations and mecA status

圖2　qacA/B基因檢測(cè)電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of the PCR products for qacA/B gene M， marker； Lane 1-4， Lane5-7： 507， 509， 511， 520， 534， 541， 557 test strains. Lane 8： TS77， qacA/B-positive strain； Lane 9： negative stain.

圖3　spa分型電泳圖Figure 3 Electrophoresis for spa typing of S. aureus strains M， marker； Lane 1-7： 507， 509， 511， 520， 534， 541， 557 test strains.

表2　7株qacA/B陽(yáng)性細(xì)菌SPA重復(fù)序列的特征及分型Table 2 Spa typing of the 7 strains of qacA/B-positive S. aureus based on the features of spa repetitive sequences

表3　qacA/B陽(yáng)性的金葡菌臨床資料Table 3 Clinical details of the qacA/B-positive S. aureus strains

表4　qacA/B陽(yáng)性金葡菌對(duì)常用抗菌藥物耐藥模式Table 4 Resistant pattern of qacA/B-positive S. aureus strains to commonly used antimicrobial agents

3　討論

mecA基因的檢出是確證MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果顯示mecA基因的檢出率與金葡菌對(duì)頭孢西丁的耐藥率是一致的，藥敏結(jié)果提示7株攜帶有qacA/B基因的金葡菌6株為mecA基因陽(yáng)性菌株，消毒防腐劑類對(duì)帶有qacA/B基因菌株的MIC均高于未攜帶該基因菌株，菌號(hào)557未檢測(cè)出mecA基因，盡管消毒劑對(duì)該菌的MIC低于mecA陽(yáng)性菌株，但也明顯高于陰性對(duì)照菌株，表明MSSA也可攜帶耐消毒劑基因，提示可能增加社區(qū)金葡菌感染的傳播。

我院的qacA/B檢出率明顯高于WEI等［18］報(bào)道的qacA/B的檢測(cè)率9.1%，MRSA中qacA/B的檢出率為17.1%，2006年黃支密等［19］首次報(bào)道國(guó)內(nèi)MRSA菌株檢出qacA/B基因，其后國(guó)內(nèi)其他地區(qū)報(bào)道的檢出率為38%～92%［20］，本研究與日本及2001年歐洲報(bào)道的qacA/B在MRSA的檢出率44%～63%大致相當(dāng)［12，21］， MIYAZAKI等［22］2007報(bào)道MRSA中qacA/B的檢出率達(dá)到80%，巴西3所醫(yī)院收集的74株MRSA中qacA/ B檢出率為80%［22］，這些檢出率的差異可能與地域不同，用藥的頻次、習(xí)慣及收集標(biāo)本的多少有關(guān)；MRSA 中qacA/B基因的陽(yáng)性檢出率高，目前已經(jīng)從MRSA菌株中檢出多種消毒劑耐藥基因（qacA/B及qacC/D家族），這可能是qacA/B等消毒劑耐藥基因多位于多重耐藥基因位點(diǎn)上，故導(dǎo)致MRSA對(duì)某些消毒劑的耐藥性與對(duì)抗菌藥物的耐藥性的關(guān)聯(lián)性，我們的藥敏實(shí)驗(yàn)中也可看到MRSA菌株的耐消毒劑水平也更高于MSSA菌株，更有利于耐藥菌的生存與傳播，因此應(yīng)當(dāng)高度重視并調(diào)查耐消毒劑基因在MRSA中的傳播，以降低醫(yī)院感染的發(fā)生。

spa分型顯示，國(guó)外MRSA主要以t001、t002為主，國(guó)內(nèi)其他地區(qū)發(fā)現(xiàn)有t030及t037流行［23］，此次我們的研究中并未發(fā)現(xiàn)新的spa分型菌株，本研究對(duì)象是攜帶耐消毒劑基因的MRSA，但也與國(guó)內(nèi)流行趨勢(shì)一致，另外也說(shuō)明spa分型存在很強(qiáng)的地域性，有助于不同地區(qū)實(shí)驗(yàn)室的比較。臨床資料結(jié)合spa分型可以看到我院兒科可能存在醫(yī)院攜帶有qacA/B MRSA克隆株的流行。

本研究的不足之處主要為我院存在臨床標(biāo)本送檢率及檢出率不高，因此1年時(shí)間僅收集51株，樣本量小，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能出現(xiàn)偏倚。

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2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，重慶市傳染病寄生蟲(chóng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

中圖分類號(hào)：R378.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-7708（2016）03-0340-06

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.016

收稿日期：2015-06-15 修回日期：2015-08-15

基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)科研面上項(xiàng)目（2013-2-286）。

作者簡(jiǎn)介：1.重慶市奉節(jié)縣人民醫(yī)院感染科，重慶 404600； 吳建國(guó)（1973—），男，副主任醫(yī)師，主要從事細(xì)菌耐藥性分析及致病機(jī)制研究。

通信作者：賈蓓，E-mail：beijia2008@yeah.net。

Detection of disinfectant-resistant gene in Staphylococcus aureus

WU Jianguo， HUANG Yuqing， YAN Ming， LIU Chengwei， HUANG Wenxiang， JIA Bei. （Department of Infectious Diseases， Chongqing Fengjie County People's Hospital， Chongqing 404600， China）

Abstract:Objective To detect the disinfectant-resistant gene qacA/B in the strains of Staphylococcous aureus isolated from January 2014 to December 2014. Methods Fifty-one isolates were collected. PCR assay was used to detect mecA gene and qacA/ B gene in the isolates followed by Staphylococcus protein A （spa） typing. Antimicrobial-resistant phenotypic typing was conducted to analyze the homology of these qacA/B positive strains. The clinical information of the patients from whom the strains were isolated was collected to further understand the clinical background of qacA/B-carrying S. aureus. Results The prevalence of mecA and qacA/B genes was 21.6% （11/51） and 13.7% （7/51）， respectively in the strains. The prevalence of qacA/B gene in the methicillinresistant S. aureus strains （54.5%， 6/11） was signifcantly higher than that in the methicillin-sensitive S. aureus strains （2.50%， 1/40）. The prevalence of mecA gene in qacA/B gene positive strains （6/7） was signifcantly higher than that in qacA/B gene negative strains （1/7）. These qacA/B positive strains were classifed into 4 spa types （t037， t091， t932 and t895）. The main type was t037 （4/7）， which was from the pediatric ward. Conclusions The prevalence of qacA/B gene is low in the S. aureus strains. However， the prevalence of this gene in methicillin-resistant S. aureus strains is far higher than that in methicillin-sensitive S. aureus. spa type t037 may be a prevalent clone in pediatric ward.

Key words:Staphylococcus aureus； disinfectant-resistant gene； qacA/B； mecA； spa typing