血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染時對T淋巴細胞數量和Toll樣受體的影響

林澤輝， 陳國寧， 杜永明

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血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染時對T淋巴細胞數量和Toll樣受體的影響

林澤輝， 陳國寧， 杜永明

摘要：目的 觀察血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染時對T淋巴細胞數量和Toll樣受體（TLR）的作用。 方法 選取2013年1月—2014年12月重癥腹腔感染患者78例，隨機分為對照組和觀察組（每組39例），兩組患者均接受常規基礎治療，觀察組患者在常規治療基礎上靜脈滴注血必凈注射液，50 mL/次，2次/d，連用2周。治療前及治療2周時抽取患者靜脈血采用流式細胞術測定T淋巴細胞水平，分離外周血單個核細胞（PBMC）并采用熒光實時PCR測定TLR2和TLR4表達水平，記錄兩組患者入院時及治療2周時的急性生理與慢性健康評分（APACHEⅡ評分）和胃腸功能評分。結果 治療2周時，觀察組患者外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均較對照組患者顯著升高（P＜0.01），而CD8+水平較對照組患者顯著降低（P＜0.01）；觀察組患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平均較對照組患者顯著降低（P＜0.01）；觀察組患者APACHE Ⅱ評分和胃腸功能評分均較對照組患者顯著降低（P＜0.01）。結論 血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染時可改善患者的T淋巴細胞數量及降低外周血PBMC上TLR的表達。

關鍵詞：血必凈注射液； 重癥腹腔感染； T淋巴細胞； Toll樣受體

腹腔感染是指各種病原菌引起的腹腔內感染，通常為腸桿菌科細菌、腸球菌屬和擬桿菌屬等混合感染，是外科最常見的感染性疾病之一。重癥腹腔感染是指合并膿毒癥與膿毒癥休克的腹腔感染，是外科ICU常見的危重癥和主要死亡原因之一［1-2］。膿毒癥主要以器官功能損害為特征，是影響ICU患者生存的最大威脅，是引起危重患者晚期死亡的首要原因［3］。雖然近年來抗感染治療及器官功能支持技術也不斷進步，但是膿毒癥的臨床預后仍然較差。重癥腹腔感染患者普遍存在免疫紊亂，而免疫調節可以逆轉重癥感染后期的免疫抑制狀態以及改善預后。Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）可啟動特異性病原免疫應答反應以及細胞特異性免疫應答反應而發揮抗感染作用［4］。本研究觀察血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染時對患者T淋巴細胞數量以及TLR2和TLR4的影響。

1　材料與方法

1.1臨床資料

選取2013年1月—2014年12月本院ICU收治重癥腹腔感染患者78例，其中男43例（55.1%），女35例（44.9%），年齡48～78歲平均65歲。所有患者入院時有腹痛、腹脹癥狀和全腹膜炎體征，并且腹腔引流液或穿刺液經細菌學檢查證實感染的存在，經診斷消化道穿孔29例（37.2%）、急性化膿性闌尾炎穿孔21例（26.9%）、重癥急性胰腺炎18例（23.1%），以及其他10例（12.8%，包括急性梗阻性化膿性膽管炎6例，腸系膜動脈栓塞4例）。患者納入標準如下：①年齡＞18周歲；②具有腹膜刺激征，發熱，血白細胞計數升高，并且符合膿毒癥診斷標準［5］；③急性生理和慢性健康評分Ⅱ（APACHE Ⅱ評分）≥8分；④預計生存時間＞2周。本研究開展前得到醫院倫理委員會批準，所有納入患者或家屬均簽署知情同意書。患者依照隨機數字表按1∶1分為觀察組和對照組，每組39例。兩組患者的年齡、性別、病因、感染持續時間、APACHE Ⅱ評分等臨床資料具有可比性（P＞0.05），見表1。

表1　兩組患者臨床資料比較Table 1 Clinical data of the patients in both groups

1.2方法

兩組患者常規給予抗感染、液體復蘇、預防應激性潰瘍、控制血糖、器官支持、腸外營養等，同時盡可能尋找腹部感染灶并行積極的沖洗引流措施。治療中及時根據腹腔膿液細菌培養結果和藥物敏感試驗結果調整抗生素使用。觀察組患者在常規治療上靜脈滴注血必凈注射液，50 mL/次，2次/d，連用2周。治療前及治療2周時抽取患者靜脈血采用流式細胞術測定T淋巴細胞水平，分離外周血單個核細胞（PBMC），采用熒光實時PCR測定TLR2和TLR4表達水平。記錄兩組患者入院時及治療2周時的APACHEⅡ評分和胃腸功能評分［6］。胃腸功能評分標準如下：禁食、胃腸減壓、腸鳴音減弱各為1分；反流、胃潴留、腹脹、腹痛、腹瀉、腸鳴音消失、便秘各2分。

1.2.1 T淋巴細胞的測定 抽取外周靜脈血5 mL 于EDTA抗凝管內，應用B.D.TEST（美國BD公司）直接免疫熒光標記全血細胞，CD3+、CD4+和CD8+單克隆抗體分別采用異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）標記和多甲藻（黃）素葉綠素蛋白復合物（PerCP）進行標記后，加入FACS Lysing（美國BD公司）溶解紅細胞后應用FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）檢測淋巴細胞及其亞群，采用CELLQUEST SET 軟件（美國BD公司）進行T細胞亞群的分析。

1.2.2 TLR2和TLR4測定 抽取外周靜脈血5 mL，采用Ficoll-hypzue淋巴細胞分離液（上海華精高科技有限公司）分離得PBMC，用Trizol試劑（美國Invotrigen公司）提取PBMC內總RNA，取2 μg RNA加5 μL DEPC水，70℃水浴5 min，立即置于冰中進行反轉錄。TLR2和TLR4上游引物分別為5’-GAA GAA TCC TCC AAT CAG GCT TC-3’、 5’-AGG ATG ATG CCA CCA TGA TGG TC-3’，其下游引物分別為5’-GCC CTG AGG GGA ATG GAC TTT-3’、 5’-TCA GGT CCA GGT FCT FGG GTG AG-3’，產物長度分別為657 bp和550 bp。GAPDH為內參，上游引物為5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游引物為5’-TTG GTG AAG ACG CCA GTG GA-3’，產物長度為151 bp。反轉錄條件如下：42℃ 15 min，85℃5 min，4℃ 5 min。實時熒光定量PCR測定PBMC 中TLR2和TLR4的水平，PCR反應體系：ddH2O 13.8 μL，2×SYBR Mix 8.4 μL，上下游引物各0.35 μL，Taq酶0.1 μL，標本cDNA模板2 μL。擴增條件為：94℃ 2 min；94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環。以2-ΔΔCt法計算TLR2和TLR4 mRNA的表達量。

1.2.3 臨床評價 記錄兩組患者入院時及治療2周時的病情（APACHEⅡ評分、胃腸功能評分）。1.2.4 統計學處理 數據處理采用SPSS 18.0。計量數據組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組患者T淋巴細胞的比較

治療前兩組患者外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療2周時兩組患者外周血CD3+、CD4+和CD4+/ CD8+水平較治療前顯著升高（P＜0.01），CD8+水平較治療前顯著降低（P＜0.01），并且組間差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2　兩組患者治療前及治療2周時T淋巴細胞水平的比較Table 2 Number of T lymphocytes before and after 2-week Xuebijing treatment in both groups

2.2兩組患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA的比較

治療前兩組患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平差異無統計學意義（P＞0.05）；治療2周時兩組患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平均較治療前顯著降低（P＜0.01），組間差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

2.3兩組患者治療前及治療2周時的病情比較

治療前兩組患者APACHE Ⅱ評分和胃腸功能評分差異無統計學意義（P＞0.05）；治療2周時兩組患者APACHE Ⅱ評分和胃腸功能評分均較治療前顯著降低（P＜0.01），組間差異有統計學意義（P＜0.01），見表4。

表3　兩組患者治療前及治療2周時外周血PBMC TLR2 和TLR4 mRNA的比較Table 3 Levels of TLR2 and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of before and after 2-week Xuebijing treatment compared between groups

表4　兩組患者治療前及治療2周時病情的比較Table 4 Disease status of the patients before and after 2-week Xuebijing treatment compared between groups

3　討論

重癥腹腔感染以需氧菌和厭氧菌的混合感染為主，患者病情危重，常繼發下呼吸道、血液等部位的醫院獲得性感染。重癥腹腔感染伴隨著內皮細胞、血小板、白細胞和凝血纖溶系統以及多種炎性因子的相互作用，易繼發多器官功能衰竭，最終因多器官功能障礙綜合征導致治療失敗［7-8］。血必凈注射液是由天津紅日藥業股份有限公司生產的中藥復方注射劑，由紅花、川芎、丹參、當歸等組成，可化瘀解毒，用于溫熱類疾病，癥見發熱、喘促、心悸、煩躁等瘀毒互結證。現代藥理研究證實，血必凈注射液具有減少自由基、改善微循環、保護內皮細胞等功能［9-10］。此外，血必凈注射液具有拮抗炎性反應遞質以及內毒素的功效，能有效提高超氧化物歧化酶以及減少纖維蛋白的功效，同時對免疫系統具有雙向調節功能［11-12］。目前臨床上關于血必凈注射液用于治療重癥腹腔感染相關研究相對有限。本研究顯示，治療2周時觀察組患者APACHE II評分和胃腸功能評分均較對照組患者降低（P＜0.01），研究結果顯示血必凈注射液輔助治療可顯著改善重癥腹腔感染患者的病情。

近年來，人們注意到免疫功能紊亂是導致重癥感染發展并發多器官功能障礙的重要原因。T淋巴細胞是一類重要的免疫細胞，正常機體內T淋巴細胞及各亞群相對穩定。T細胞的比值和絕對數發生改變被認為是免疫功能紊亂，CD4+/CD8+比值常作為一種評價免疫功能的臨床指標［13］。有研究表明，提高膿毒血癥患者CD4+T淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值可以提高患者的生存率［14］。本研究結果顯示，治療2周時觀察組患者外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均較對照組患者顯著升高（P＜0.01），而CD8+水平較對照組患者顯著降低（P＜0.01），因此血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染患者可顯著改善患者機體的免疫紊亂狀態。機體發生感染后，局部的炎性反應對細菌/毒素的清除以及組織的修復具有重要作用，但是炎性反應過度活化可導致正常機體組織損傷。在膿毒癥的發生發展過程中始終存在著炎性反應亢進，而過度全身炎性反應也能誘發多種免疫細胞凋亡。TLR是一類表達于細胞膜或膜內的模式識別受體，其主要功能是誘發炎性反應、誘導樹突細胞的成熟和激活Th1或Th17細胞，發揮抗感染作用［15］。TLR持續激發的炎性反應或破壞體內穩態平衡，引起自身免疫性疾病、慢性炎癥等［16］。TLR既可作為病原模式識別受體又可作為危險模式識別受體在不同程度損傷中起到始動作用［17］。有研究顯示，全身炎性反應綜合征、肝臟移植術后患者體內TLR 2和TLR 4表達上調，并認為TLR 2和TLR 4的上調有助于全身炎性反應綜合征發生［18］。TLR 2和TLR 4通過激動NF-κB 促進各種細胞因子及炎癥介質基因的轉錄合成，促進其表達各種損傷介質，打開下游的損傷過程［19］。因此，阻斷TLR可能下調重癥感染的炎性反應。TIDSWELL等［20］使用TLR4拮抗劑治療重癥感染，發現TLR4拮抗劑有降低病死率的趨勢。本研究結果顯示，治療2周時觀察組患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平均較對照組患者顯著降低（P＜0.01），因此血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染患者可顯著降低機體外周血PBMC TLR2和TLR4 的表達。血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染可改善患者T淋巴細胞數量及降低外周血TLR表達，這是其發揮臨床治療作用的原因。

總之，血必凈注射液輔助治療重癥腹腔感染可改善患者的T淋巴細胞數量及降低外周血TLR表達。

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中圖分類號：R378.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-7708（2016）03-0257-05

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.004

收稿日期：2015-06-01 修回日期：2015-12-21

作者單位：海南省中醫院急診科，海口，570203。

作者簡介：林澤輝（1980—）男，本科，主治醫師，主要從事急診醫學研究。

通信作者：杜永明，E-mail：29015463@qq.com。

Effect of Xuebijing injection on the number of T lymphocytes and Toll-like receptors as adjuvant therapy of severe abdominal infections

LIN Zehui， CHEN Guoning， DU Yongming. （Department of Emergency Medicine， Hainan Provincial Hospital
of Traditional Chinese Medicine， Haikou 570203， China）

Abstract:Objective To examine the effect of Xuebijing Injection on the number of T lymphocytes and Toll-like receptors as adjuvant therapy of severe abdominal infections. Methods A total of 78 patients with severe abdominal infection who were hospitalized in the intensive care unit were divided into control group and treatment group. The patients in control group received conventional therapy alone， while the patients in treatment group received Xuebijing Injection （50 mL twice daily for 2 weeks）in addition to conventional therapy. Blood sample was drawn before and after 2-week treatment to determine T lymphocytes. The peripheral blood mononuclear cells were separated to determine the expression of Toll-like receptors （TLR） 2 and TLR4. The Acute Physiology and Chronic Health Evaluation （APACHE） II score and gastrointestinal function score were recorded before and after treatment. Results The levels of CD3+， CD4+and CD4+/CD8+of peripheral blood in the Xuebijing-treated patients were signifcantly higher than those in control group （P＜0.01）， but the levels of CD8+was signifcantly lower than that in control group （P＜0.01）. The levels of TLR2 and TLR4 mRNA of the peripheral blood mononuclear cells in the treatment group were signifcantly lower than those in control group （P＜0.01）. The APACHE II score and gastrointestinal function score in treatment group were signifcantly lower than those in control group （P＜0.01）. Conclusion Xuebijing Injection as adjuvant therapy of severe abdominal infection can improve the number of T lymphocytes， and reduce the expression of Toll-like receptors.

Key words:Xuebijing injection； severe abdominal infection； T lymphocyte； Toll-like receptor