珍骨膠囊對兔關節退變軟骨細胞增殖的影響

黃慶生，林喬齡，郭逸爾（福建中醫藥大學附屬漳州市中醫院，福建 漳州 363000）

珍骨膠囊對兔關節退變軟骨細胞增殖的影響

黃慶生，林喬齡，郭逸爾
（福建中醫藥大學附屬漳州市中醫院，福建 漳州 363000）

目的研究珍骨膠囊含藥血清對新西蘭大白兔退變軟骨細胞的調節作用。方法用含藥血清、空白血清對大白兔退變軟骨細胞干預，用MTT法檢測含藥血清組、空白組對軟骨細胞增殖的影響。結果含藥血清組細胞隨血清濃度的增加而加快增殖速度，與同濃度空白血清組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結論珍骨膠囊含藥血清能促進體外培養退變軟骨細胞迅速進入增殖周期，促進軟骨細胞的增殖。

軟骨細胞；珍骨膠囊；細胞增殖

1　實驗材料

1.1試劑與儀器Ⅱ型膠原酶、DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清（新西蘭Hy-clone公司）；流式細胞分析儀（美國BD公司）；CO2培養箱（德國Heraus公司）；熒光倒置顯微鏡及照相系統（日本Olympus公司）。

1.2實驗動物選擇清潔級3月齡新西蘭大白兔6只，體質量2.5 kg左右，隨機分成2組，即含藥血清組3只，空白血清組3只。

1.3藥物組成與來源珍骨膠囊由淫羊藿、肉蓯蓉、紫河車、黨參、田七、兩面針等組成，是福建省漳州市中醫院院內制劑，由本院制劑室制備。

2　實驗方法

2.1制作珍骨膠囊含藥血清大白兔所用生物劑量按照人與動物千克體質量換算。大白兔每kg體質量每日用藥2 g，2.5 kg大白兔每日用量5 g。以上藥粉以生理鹽水10 mL溶解灌服，每只大白兔每日灌胃2次，每日早8點、晚4點各1次。空白血清組灌服生理鹽水10 mL/d，2組連續灌胃3 d，在最后1次灌胃3 h后腹主動脈抽取全血，離心后經56℃水浴滅活后，再經過過濾除菌，-20℃保存。

2.2制取退變關節的軟骨細胞

2.2.1動物模型的準備造模組采用改良 Hulth方法造模，取新西蘭大白兔3只，術前準備，用氯胺酮靜脈麻醉，配合利多卡因局部浸潤麻醉，取兔右后肢膝關節內側手術入路，顯露出內側副韌帶，并將其切斷，開放關節囊去除內側半月板及前交叉韌帶。術后3 d青霉素肌肉注射防止感染，每日2次，每日20萬U。手術后第7天，開始每日強迫大白兔活動1次，每次500 m。

2.2.2關節退變軟骨細胞的獲取與培養［1］手術后第8周，動物處死后，消毒雙膝并離斷膝關節，剝離膝關節周圍附著的軟組織，包括韌帶、關節囊，切取關節表面的軟骨，剪成1 mm×1 mm大小，用0.25%胰蛋白酶于室溫下搖床內振蕩消化30 min，再用0.2%Ⅱ型膠原酶消化2次，收集消化所得的軟骨細胞懸液，并將（2～3）×105細胞/m L密度的軟骨細胞接種于有DMEM培養液的培養瓶中。每2天更換1次。培養過程中通過Ⅱ型膠原染色法鑒定關節退變軟骨細胞來準確獲取。具體按照ABC法Ⅱ型膠原免疫組化染色，蘇木精襯染。染色后細胞胞漿呈棕黃色，染色陽性，提示有Ⅱ型膠原的表達。

2.3MTT法檢測不同濃度珍骨膠囊含藥血清對軟骨細胞增殖的影響在48孔板中以2×103/孔接種F3細胞，貼壁后分別加入含 10%、15%、20%、30%含藥血清或生理鹽水空白血清的DMEM培養基，每個濃度設12孔。培養72 h，放棄培養基，每孔加入10μL 0.5%MTT溶液，37℃溫度下培育4 h，棄除MTT，加入100μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解晶化物。在酶聯免疫檢測儀中，將波長測定為570 nm，然后測定各孔光吸收值（OD值），記錄結果。

2.4珍骨膠囊含藥血清干預退變的軟骨細胞后軟骨細胞周期的變化在培養皿中以1×105/mL傳代接種生長良好的第3代軟骨細胞，分別加入15%胎牛血清的DMEM培養液，細胞貼壁后，去除含有血清的培養基，加入單純DMEM培養液，饑餓24 h，使細胞同步化，即G0或G1期，再隨機分成含藥血清組和空白組，分別加入最佳濃度珍骨膠囊含藥血清的DMEM培養基和相應濃度生理鹽水血清培養基，流式細胞分析儀分別檢測培養24、48、72 h后的軟骨細胞周期分布。

3　結果

3.1軟骨細胞形態學觀察貼壁的退變軟骨細胞饑餓24 h后，軟骨細胞胞體積變小，數量變少，部分軟骨細胞胞體回縮，并可見透亮、變圓，甚至壞死，見圖1。貼壁后的退變軟骨細胞饑餓24 h后，隨機分組，分別用珍骨膠囊含藥血清、生理鹽水空白血清干預，24 h后實驗發現2組軟骨細胞數量均快速增加，但含藥血清組細胞個體較大，形態相似，數量明顯增多，排列較為整齊；48 h后，盡管2組軟骨細胞基本融合，但含藥血清組比空白血清組軟骨細胞快速增長聚集，形成細胞小結，細胞間邊界不清晰。72 h后2組均見有散在的細胞小結，但空白血清組軟骨細胞體較小，見圖2、圖3。

3.2不同濃度含藥血清對退變軟骨細胞增殖的影響實驗發現含藥血清組其軟骨細胞增殖速度隨著含藥血清濃度增加而加快，當含藥血清濃度達到20%時其增殖速度最快，與同一濃度空白血清組相比，有統計學意義（P＜0.05）。然而其增長速度沒有和血清濃度呈正比，隨著含藥血清濃度的增加，軟骨細胞的增殖速度并沒有一直增長，反倒有下降的趨勢，見表1。空白血清組軟骨細胞隨血清濃度增加增殖速度未見明顯改變，當濃度為30%時，軟骨細胞增殖速度反而明顯降低。

表1　2組不同濃度血清對退變軟骨細胞增殖的影響對比（±s）%

表1　2組不同濃度血清對退變軟骨細胞增殖的影響對比（±s）%

注：與空白血清組比較，1）P＜0.05。

組別含藥血清組空白血清組30 0.517±0.021 0.549±0.017 10 0.552±0.019 0.539±0.023 15 0.583±0.013 0.554±0.012 20 0.634±0.0291）0.586±0.015

3.3含藥血清干預后對退變軟骨細胞周期分布的測定見表2。隨著培養時間的推移以及血清干預，2組軟骨細胞周期分布發生變化，其G0/G1期細胞比例下降，而S期、G2/M期細胞比例上升，PI升高，以含藥血清組變化顯著。干預24、48、72 h，含藥血清組G0/G1期細胞比例明顯低于同期空白血清組，有顯著性差異（P＜0.05）。干預24、48、72 h，S期、G2/M期細胞比例及 PI均高于同期空白血清組，除干預72 h除G2/M期細胞比例外，其余差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

4　討論

4.1中藥具有簡、便、廉、驗的優點，對于骨關節炎療效確切［2］。珍骨膠囊含藥血清促進軟骨細胞增殖的作用骨性關節炎屬中醫“痹證”范疇，內因與肝、脾、腎相關，外因與風、寒、濕、瘀血相關。中醫治療骨性關節炎多采用補肝腎健脾，祛風散寒除濕，舒筋活血通絡。我院應用珍骨膠囊60余載，對痹證日久，肝腎兩虛患者療效顯著。珍骨膠囊內含淫羊藿、肉蓯蓉、紫河車、黨參、三七、兩面針6味中藥，淫羊藿溫腎壯陽，強筋骨，祛風濕，為君藥；肉蓯蓉溫補腎陽，益精血；紫河車補氣，養血，益精，為臣藥；黨參補脾益肺；三七化瘀止血，活血定痛；佐以兩面針行氣止痛，通絡祛風。諸藥合用，達到補腎養血、通絡祛風的功效。

4.2研究表明軟骨細胞的增殖與細胞周期調節密切相關，細胞周期的調節可以影響細胞的增殖、分化和凋亡。因此，通過調控細胞周期，可以促進軟骨細胞增殖。同時細胞中的DNA含量與細胞周期密切相關，并隨著細胞周期變化而發生變化［4］。DNA分析反映著細胞生長增殖的具體過程，其中G0期細胞是尚未進入增殖狀態的靜止期細胞，G1期為DNA合成前期，S期為DNA合成期，在S期結束后DNA由二倍體成為四倍體，進入G2期，G2期主要為分裂期（M期）儲備能量。文獻顯示細胞增殖指數（PI）是反映細胞增殖的重要指標之一，顯示DNA合成速度和細胞增殖情況［5］。它是S期與G2/M期DNA含量之和與S期、G2/M及G0/G1期DNA含量總和的比值。本研究將珍骨膠囊含藥血清組與空白血清組對照，實驗結果顯示，珍骨膠囊含藥血清能促進軟骨細胞進入增殖周期，隨著干預時間的延長，G0、G1期細胞比例下降，S期、G2/M期細胞比例上升，PI升高。干預24、48、72 h后G0、G1期細胞比例降低，S期與G2/M期細胞之和增加。干預24、 48、72 h，S期、G2/M期細胞比例及PI均高于同期空白血清組，有顯著性差異（P＜0.05）。提示珍骨膠囊含藥血清可以促使更多體外培養退變軟骨細胞迅速進入增殖周期，推進退變軟骨細胞由G0/G1期向S期、G2/M期推進，推動細胞周期的進程，促進退變軟骨細胞增殖。將干預前的退變軟骨細胞饑餓24 h，使細胞周期同步為G0/G1期［6］，可見細胞體積回縮變小。用珍骨膠囊含藥血清后，細胞迅速增殖，胞體增大明顯，48 h后形成細胞小結。本實驗通過對新西蘭大白兔含藥血清的觀察，發現珍骨膠囊含藥血清能有效促進退變軟骨細胞的增殖。

表2　退變軟骨細胞周期分布（%）

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［6］M.PAGAN.細胞周期——材料和方法［M］.北京：人民衛生出版社，2000：88-89.

R285.5

A

1000-338X（2016）01-0030-03珍骨膠囊是我院院內制劑，在治療骨關節炎臨床實踐中，療效顯著。本研究是在中醫理論的指導下，運用細胞生物學的研究方法，觀察含藥血清對退變軟骨細胞增殖的影響，旨在從細胞分子水平探討珍骨膠囊調控軟骨細胞增殖的作用機制。

2015-11-17

福建省衛生廳青年科研基金資助課題（2012-2-115）

黃慶生（1980—），男，主治醫師，醫學碩士，主要從事四肢創傷及小兒骨科的臨床研究。