東北紅豆杉抗寒性分析

賀川江， 張淑英， 李先榮， 金曉梅

(1．石河子市園林研究所，新疆石河子 832000；2．石河子大學農(nóng)學院，新疆石河子 832003)

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東北紅豆杉抗寒性分析

賀川江1， 張淑英2*， 李先榮1， 金曉梅1

(1．石河子市園林研究所，新疆石河子 832000；2．石河子大學農(nóng)學院，新疆石河子 832003)

摘要[目的]分析東北紅豆杉在引種地新疆石河子的抗寒性。[方法]通過5個低溫處理試驗，測定葉片葉綠素含量、丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)、超氧物歧化酶(SOD)活性、質(zhì)膜透性、可溶性糖(SS)指標。[結(jié)果]隨著溫度降低，東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量和SOD活性依次降低，而質(zhì)膜透性、Pro、MDA和SS含量遞增。[結(jié)論]東北紅豆杉對-30 ℃低溫具有較好的抗逆性。

關(guān)鍵詞東北紅豆杉；抗寒性；低溫

東北紅豆杉(Taxus cuspidateSieb.etZucc.)又稱紫杉、赤柏松，為紅豆杉科紅豆杉屬常綠針葉喬木，原產(chǎn)于我國東北的長白山等地。東北紅豆杉兼具藥用、材用和觀賞價值[1]，其自然分布零星、稀少，是瀕臨滅絕的國家一級保護樹種。為了增加?xùn)|北紅豆杉種群數(shù)量，擴大其地理分布范圍，保護并更好地開發(fā)利用東北紅豆杉資源，科研人員將東北紅豆杉引種到新疆的石河子。低溫凍害等非生物脅迫是新疆常見的逆境因子，也是影響新疆植物正常生長發(fā)育的主要環(huán)境因素[2-4]。為給石河子開展東北紅豆杉的引種馴化、繁育促培及種植推廣應(yīng)用提供科學依據(jù)，筆者就引種的東北紅豆杉苗對新疆低溫凍害等逆境因子的生理響應(yīng)進行了試驗分析。

1材料與方法

1.1供試材料試驗所用的植物材料為新疆石河子市園林研究所從東北吉林通化長白山區(qū)引種栽培的5年生東北紅豆杉。將東北紅豆杉苗栽培在規(guī)格為21cm×21cm盆缽內(nèi)，每缽留苗1株，置于露地養(yǎng)護。盆栽土壤取自石河子市園林研究所院內(nèi)肥料池，按肥料土∶腐熟鋸末∶細沙=10∶3∶1配制。

1.2試驗設(shè)計設(shè)置5個溫度處理，分別為20(CK)、-30、-35、-40、-45 ℃，記為處理①～⑤。將東北紅豆杉缽苗先置于光照培養(yǎng)箱中降溫至0 ℃后，再搬入超低溫冰柜中開始進行低溫處理，各處理采取逐漸降溫的方法(即每天降溫5 ℃，待2d后小苗適應(yīng)低溫，繼續(xù)降溫)。低溫處理2～3d后取樣，在實驗室內(nèi)分別對葉片質(zhì)膜透性(電導(dǎo)率)、葉綠素、超氧物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(Pro)含量、可溶性糖(SS)含量進行測試分析。

1.3取樣方法

1.3.1葉綠素測定取樣。從每個處理2個重復(fù)中隨機選定2株幼苗，摘下功能葉片，剪碎，測定葉綠素a、b含量。

1.3.2酶活性測定取樣。摘取處理后的東北紅豆杉功能葉片，剪碎，定量稱取后，用錫箔紙包裹，編號，液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍儲藏，待測定。

1.4測定項目及方法

1.4.1葉綠素含量。葉綠素含量測定采用乙醇丙酮混合法[5]。稱取0.20g新鮮葉片于25mL容量瓶內(nèi)，加乙醇(95%)∶丙酮(50%)=1∶1的浸提液25mL，封口，于暗處浸提36h，至葉片呈白色，其間每隔12h振蕩片刻，使色素均勻分布于乙醇丙酮混合溶液中，分別在663、645nm處測定吸光度。

葉綠素a=12.72OD663-2.59OD645

(1)

葉綠素b=22.88OD645-4.67OD663

(2)

葉綠素=葉綠素a+葉綠素b

(3)

葉綠素含量=色素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù) / 樣品鮮重

(4)

1.4.2丙二醛(MDA)含量。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[6]。吸取預(yù)先提取的粗酶液2mL，加入2mL0.6%的TBA(溶于10%的三氯乙酸)溶液，將混合物置于沸水浴中反應(yīng)15min，然后快速在冰浴上冷卻，在40 000r/min離心10min，取上清液于450、532、600nm波長下測定吸光度。根據(jù)MDA在532nm處的毫摩爾消光系數(shù)為155換算出提取液中MDA濃度。

1.4.3脯氨酸(Pro)含量。采用茚三酮比色法[7]測定Pro的含量。取0.400～0.450g鮮樣于大試管中，加入5mL3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min，待冷卻至室溫后，吸取上清液2mL，加2mL冰乙酸和3mL2.5%酸性茚三酮顯色液，于沸水浴中加熱40min，冷卻后向各試管中加入5mL甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜止待分層后吸取甲苯層，在波長520nm下比色。

1.4.4超氧化物歧化酶(SOD)活性。用氮藍四唑光化學還原法[7]測定SOD活性。酶液提取：稱取0.400～0.450g葉樣，加入少許石英砂、1%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮 (PVPP)，分次加入8mL50mmol/LpH6.8磷酸緩沖液于冰浴上研磨成勻漿，4 ℃下離心20min，上清液用于SOD活性的測定。

1.4.5質(zhì)膜透性。用電導(dǎo)率儀法測定質(zhì)膜透性[5]。將東北紅豆杉功能葉用去離子水清洗3次以去除葉片表面黏附的電解質(zhì)。用直徑5mm的打孔器避開主脈取樣，混合均勻。每個重復(fù)取6片放入50mL三角瓶中，裝30mL去離子水，在25 ℃旋轉(zhuǎn)搖床上溫浴24h之后測定電導(dǎo)率(Lt)，然后煮沸20min，用流動自來水進行冷卻，立即測定各處理的煮后電導(dǎo)率(Lo)。

質(zhì)膜透性=Lt/Lo×100%

(5)

1.4.6可溶性糖(SS)含量。SS含量的測定采用蒽酮比色法[8]。

1.4.6.1標準曲線的制作。

(1)1%蔗糖標準液。將分析純蔗糖在80 ℃下烘至恒重，精確稱取1.000g。加少量水溶解，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，加入0.5mL濃硫酸，用蒸餾水定容至刻度。

(2)100μg/L蔗糖標準液。精確吸取1%蔗糖標準液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度試管11支，從0～10分別編號，分為6組(含空白),對應(yīng)6個處理，除空白外,各處理重復(fù)2次，按表1加入溶液和水。

表1蒽酮法測SS標準曲線試劑量

Table1Dosagesofthesolublesugarstandardcurvebyanthronemethod

管號Tubecode100μg/L蔗糖液100μg/Lsucrosesolution∥mL水WatermL蔗糖量Sucroseamountμg002.001/20.21.8203/40.412.6405/60.61.4607/80.81.2809/101.01.0100

按順序向試管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯試劑和5mL濃硫酸，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，逐管均準確保溫1min,取出后自然冷卻至室溫，以空白作參比，在630nm波長下測其吸光度，以吸光度為縱坐標，以糖含量為橫坐標，繪制標準曲線，并求出標準線性方程。

1.4.6.2SS的提取。取新鮮東北紅豆杉葉片，擦凈表面污物，剪碎混勻，稱取0.10～0.30g，共3份。分別放入3支刻度試管中，加入5～10mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min(提取2次)，將提取液過濾入25mL容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘渣，定容至刻度。

1.4.6.3顯色測定。吸取樣品提取液0.5mL于20mL刻度試管中(重復(fù)3次)，加蒸餾水1.5mL，以下步驟與標準曲線測定相同，測定樣品的吸光度，計算SS含量。

SS含量=從回歸方程求得糖的量/吸取樣品液體積×提取液量×稀釋倍數(shù)/(樣品干重×106)×100%

(6)

1.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS軟件(10.0)進行統(tǒng)計分析，采用Excel生成圖表。

2結(jié)果與分析

2.1低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量的影響由表2可知，低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素a含量有明顯影響。隨著溫度的降低，葉綠素a含量依次遞減。其中，葉綠素a含量最低的為-45 ℃低溫處理，比對照降低0.677mg/g，為對照的46.73%。低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素b含量的影響與葉綠素a基本相似，即隨著溫度的降低，葉綠素b含量依次遞減，其中，葉綠素b含量最低的仍為-45 ℃低溫處理，比對照降低0.302mg/g，為對照的27.40%。低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量的影響為隨著溫度的降低，葉綠素含量依次遞減，-45 ℃低溫處理比對照降低0.979mg/g，為對照的42.00%。

表2不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量

Table2ChlorophyllcontentinT. cuspidateleavesindifferenttreatments

mg/g

2.2低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)MDA含量的影響由圖1可知，隨著低溫凍害的加劇，東北紅豆杉葉片內(nèi)MDA含量逐漸增加，其中，-30 ℃低溫處理MDA含量較對照上升0.9μmol/L，而-45 ℃低溫處理MDA含量較對照增加5.8μmol/L，說明隨著溫度降低，東北紅豆杉膜脂過氧化作用越來越嚴重。

圖1　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)MDA含量Fig. 1　Effects of different treatments on the MDA content of T. cuspidate leaves

2.3低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)Pro含量的影響由圖2可知，在低溫脅迫條件下，東北紅豆杉體內(nèi)Pro含量迅速上升。-45 ℃低溫處理時，Pro含量為對照的5.31倍。

圖2　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)Pro含量Fig. 2　Effects of different treatments on the free proline content of T. cuspidate leaves

2.4低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)SOD活性的影響由圖3可知，低溫能增加?xùn)|北紅豆杉體內(nèi)活性氧的含量，降低了SOD活性。隨著處理溫度的降低，SOD活性呈下降趨勢。與對照相比，隨著溫度的降低，SOD活性降低了16.55%～69.01%，下降最顯著為-45 ℃低溫處理。

圖3　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)SOD活性Fig. 3　Effects of different treatments on the SOD activity of T. cuspidate leaves

2.5低溫對東北紅豆杉葉片質(zhì)膜透性的影響由圖4可知，低溫對東北紅豆杉葉片質(zhì)膜透性有明顯影響。隨著溫度的降低，質(zhì)膜透性受影響越大。相比于對照，各低溫處理葉片質(zhì)膜透性比對照增大0.73%～167.99%。-30 ℃低溫處理時，與對照差異不明顯，說明東北紅豆杉對-30 ℃低溫具有較好的抗逆性。

圖4　不同處理的東北紅豆杉葉片質(zhì)膜透性Fig. 4　Effects of different treatments on the membrane permeability of T. cuspidate leaves

2.6低溫對東北紅豆杉葉片內(nèi)SS含量的影響由圖4可知，在溫度逐漸降低的條件下，東北紅豆杉葉片內(nèi)SS含量逐漸增加。與對照比較，隨著溫度的降低，SS含量增加102.39%～121.56%。低溫處理與對照相比，SS含量均顯示出顯著性差異，而低溫處理之間SS含量差異不顯著。由此說明，東北紅豆杉作為抗寒性強的植物，其體內(nèi)SS含量的增加，對提高東北紅豆杉的抗寒性具有重要的作用。

圖5　不同處理的東北紅豆杉葉片內(nèi)SS含量Fig. 5　Effects of different treatments on the soluble sugar content of T. cuspidate leaves

3小結(jié)與討論

該研究表明，隨著溫度降低，東北紅豆杉葉片內(nèi)葉綠素含量和SOD活性依次降低，而質(zhì)膜透性、Pro、MDA和SS含量遞增。在該低溫試驗中，東北紅豆杉表現(xiàn)出了較強的抗寒性，對-30 ℃低溫具有較好的抗逆性。該試驗低溫處理采取逐漸降溫的方法,降溫幅度均勻,且每次降溫持續(xù)時間基本一致，這與自然降溫過程有差異，今后再做東北紅豆杉抗寒性試驗，應(yīng)注意對自然降溫過程的全真模擬及進行綜合分析。

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基金項目新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第八師石河子市科技計劃項目(2012cz02)。

作者簡介賀川江(1967- )，男，新疆石河子人，高級工程師，碩士，從事園林植物引種馴化栽培與城鄉(xiāng)綠化研究。*通訊作者，講師，博士研究生，從事作物生理生化與栽培研究。

收稿日期2016-05-03

中圖分類號S 791.49

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)16-174-03

ColdResistanceAnalysisofTaxus cuspidateSieb.etZucc.

HEChuan-jiang1,ZHANGShu-ying2*,LIXian-rong1etal

(ShiheziHorticulturalInstitute,Shihezi,Xinjiang832000; 2.CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003)

Abstract[Objective] To analyze the cold resistance of Taxus cuspidate Sieb. et Zucc. in Shihezi City of Xinjiang Province. [Method] Five low-temperature treatments were designed to test the leaf chlorophyll content, MDA content, free proline content, SOD activity, membrane permeability and soluble sugar content. [Result] With the decrease of temperature, the chlorophyll content and SOD activity in T. cuspidate leaves reduced, but membrane permeability, free proline, MDA content and soluble sugar content enhanced. [Conclusion] T. cuspidate has relatively good cold resistance to -30 ℃ low temperature.

Key wordsTaxus cuspidate Sieb. et Zucc.; Cold resistance; Low treatment