微小核糖核酸-21在乳腺癌中的表達(dá)及其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系分析

甄時建

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微小核糖核酸-21在乳腺癌中的表達(dá)及其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系分析

甄時建

【摘要】目的 探討微小核糖核酸-21（miR-2）在乳腺癌中的表達(dá)及其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 選取2014年2月至2016年2月湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院收治的65例乳腺癌患者為觀察組，其中存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；并以同期行健康體檢的65例健康成人及收治65例乳腺良性病變患者作為對照A組與對照B組。分別對采集的血清標(biāo)本與乳腺細(xì)胞依次開展miR-21臨床檢驗，評估其在乳腺癌中的表達(dá)并分析與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果 觀察組患者的miR-21相對表達(dá)量明顯高于A組與B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者 miR-21相對表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MCF-7、MDA-MB-231與 MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的 miR-21相對表達(dá)量均明顯高于 HBL-100組，且 MDA-MB-231與MDA-MB-468侵襲性乳腺癌細(xì)胞的miR-21相對表達(dá)量明顯高于MCF-7非侵襲性乳腺癌細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的MDA-MB-231侵襲性人乳腺癌細(xì)胞遷移至小室細(xì)胞數(shù)量與穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)量均明顯低于A組乳腺細(xì)胞，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 乳腺癌患者的miR-21呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平同癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，抑制miR-21水平有利于控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】腫瘤標(biāo)記；乳腺癌；微小核糖核酸-21；腫瘤轉(zhuǎn)移

近年來，病理生物學(xué)在對多種腫瘤及病毒感染性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)了微小核糖核酸-21（miR-2），該物質(zhì)是一種非編碼的小分子核糖核酸（RNA），可通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)移［1-2］。既往研究表明，腫瘤細(xì)胞微小核糖核酸（miRNA）呈高度穩(wěn)定狀態(tài)存在于腫瘤患者血清中，提示特異性miRNA可作為腫瘤標(biāo)志物之一［3］。本研究就 miR-21在乳腺癌中的表達(dá)及其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2016年2月我院收治的65例乳腺癌患者為觀察組，本組患者均在手術(shù)治療前開展血清標(biāo)本收集，且均未接受過放療、化療及免疫等治療措施，并以同期行健康體檢的65名健康成人及收治65例乳腺良性病變患者作為對照A組與對照B組。觀察組患者年齡35～66歲，平均（50±5）歲，其中存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 39例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；A組健康體檢者年齡32～65歲，平均（51±5）歲；B組患者年齡33～67歲，平均（51±5）歲。3組受試對象一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，且均于試驗前簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 CFX96定時定量基因擴增儀（美國Bio-rad公司）；miRNA提取試劑盒、miR-21抑制劑（美國Omega）；基質(zhì)膠（美國BD公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒與TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）；TaqMan miRNA定量分析試劑盒（美國ABI公司）；侵襲小室與培養(yǎng)基（美國Corning公司）；整合SV40基因的乳腺上皮細(xì)胞（HBL-100）、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞及MDAMB-468人乳腺癌細(xì)胞（ATCC）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HBL-100人乳腺上皮細(xì)胞，RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7非侵襲性人乳腺癌細(xì)胞，L15培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231 與MDA-MB-468侵襲性人乳腺癌細(xì)胞。上述培養(yǎng)基中應(yīng)均加雙抗、10%胎牛血清與5% CO2，培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為37 ℃。

1.2.3 檢測方法 采用實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組樣本 miR-21的表達(dá)情況，先應(yīng)用 TRIzol試劑提取總RNA，再根據(jù)miRNA提取試劑盒操作要求測定miR-21。將3 μl逆轉(zhuǎn)錄酶加入10 ng總RNA中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃5 min。將獲取產(chǎn)物稀釋150倍后與2 μl TaqMan引物混合，95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共計40個循環(huán)。血清樣本的miRNA水平以cel-miR-39作為對照，表達(dá)采用2－△ct計算；細(xì)胞miRNA水平以 U6 小核核糖核酸（snRNA）作為對照組，采用2－△△ct計算。

1.2.4 乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的測定 接種 MDAMB-231侵襲性人乳腺癌細(xì)胞后24 h，觀察其貼壁細(xì)胞數(shù)量并適時給予轉(zhuǎn)染，根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒相關(guān)操作指示將miR-21抑制劑轉(zhuǎn)染于MDA-MB-231侵襲性人乳腺癌細(xì)胞中。48 h后制備細(xì)胞懸液，并開展微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell）小室上室接種。根據(jù)其指示說明將10%FBS溶液與培養(yǎng)基加入侵襲小室下室，再分別加入細(xì)胞懸液。以37 ℃培養(yǎng)1～2 d，再應(yīng)用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，有細(xì)胞穿出時停止實驗。固定、染色后行顯微鏡觀察并拍照，細(xì)胞計數(shù)以 5個視野為準(zhǔn)，提取結(jié)果計算均值來表現(xiàn)侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用 F/t檢驗，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者血清檢測中miR-21表達(dá)水平比較 觀察組患者的miR-21相對表達(dá)量明顯高于A組與B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1；觀察組中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-21相對表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1　 3組受試對象miR-21表達(dá)水平比較（±s）

表1　 3組受試對象miR-21表達(dá)水平比較（±s）

組別 　例數(shù) 　miR-21相對表達(dá)量A組 　65 　1.36±0.24 B組 　65 　0.81±0.16觀察組 　65 　2.71±0.82 F值 　　4.97 P值 　?。?.05

表2　 觀察組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-21表達(dá)水平比較（±s）

表2　 觀察組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-21表達(dá)水平比較（±s）

組別 　例數(shù) 　miR-21相對表達(dá)量無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 　26 　2.2±0.7淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 　39 　3.6±1.1 t值 　　3.93 P值 　?。?.05

2.2 乳腺癌細(xì)胞 miR-21表達(dá)水平比較 MCF-7、MDA-MB-231與MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的miR-21相對表達(dá)量均明顯高于HBL-100組，且MDA-MB-231與MDA-MB-468侵襲性乳腺癌細(xì)胞的miR-21相對表達(dá)量明顯高于MCF-7非侵襲性乳腺癌細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3　 乳腺癌細(xì)胞miR-21表達(dá)水平比較（±s）

表3　 乳腺癌細(xì)胞miR-21表達(dá)水平比較（±s）

注：與HBL-100組比較，△P＜0.05；與MCF-7比較，▲P＜0.05

組別 　　miR-21相對表達(dá)量HBL-100 　　0.97±0.08 MCF-7 　　1.96±0.16△MDA-MB-231 　　4.03±0.47△▲MDA-MB-468 　　3.82±0.89△▲

2.3 miR-21對MDA-MB-231侵襲性乳腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的影響 A組乳腺細(xì)胞遷移至小室細(xì)胞數(shù)量為（256±34），穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)量為（133±42），MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞遷移至小室細(xì)胞數(shù)量為（98±22），穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)量為（44±17）；轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑的MDA-MB-231侵襲性人乳腺癌細(xì)胞遷移至小室細(xì)胞數(shù)量與穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)量均明顯低于A組乳腺細(xì)胞，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，主要為乳腺腺上皮組織發(fā)生惡性病變，好發(fā)于40～60歲婦女，以圍絕經(jīng)期為高發(fā)階段。乳腺腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者病死的主要原因，而病灶轉(zhuǎn)移為多基因參與的復(fù)雜過程，其發(fā)生機制尚未完全明確［4］。近年來，臨床對于惡性腫瘤的病理生物學(xué)研究取得了較大進(jìn)展，多項研究均證實miRNA與其發(fā)病、進(jìn)展均具有密切關(guān)系［5］。miR-21在非實體瘤與實體瘤等疾病中往往都呈高表達(dá)狀態(tài)，作為首個在惡性疾病患者血清中發(fā)現(xiàn)的 miRNA，受到了臨床的高度重視［6］。既往研究認(rèn)為，miR-21可促進(jìn)靶向細(xì)胞相關(guān)基因凋亡，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移［7］。傅少梅等［8］的研究表明，針對患者開展miR-21檢測可輔助三陰性乳腺癌的診斷；吳稚暉等［9］也指出，中晚期非小細(xì)胞肺癌患者的miR-21呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與化療效果成正相關(guān)；王卉等［10］研究則證實，乳腺癌患者血清與細(xì)胞中miR-21均為高表達(dá)狀態(tài)，與其腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移也具有一定關(guān)聯(lián)。

本研究分別對乳腺癌、乳腺良性病變患者與正常女性的miR-21的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示乳腺癌患者的miRNA-21表達(dá)均顯著高于其他兩組，同時乳腺癌患者中發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移患者的miRNA-21水平更高。提示miR-21表達(dá)同乳腺癌發(fā)病與進(jìn)展密切相關(guān)。為進(jìn)一步證實兩者之間的相關(guān)性，研究分別對正常乳腺細(xì)胞、非侵襲性乳腺癌細(xì)胞與侵襲性乳腺癌細(xì)胞的miR-21進(jìn)行了測定，結(jié)果表明乳腺癌細(xì)胞的miRNA水平明顯高于正常乳腺細(xì)胞，并且侵襲性乳腺癌細(xì)胞的miRNA水平更高。證實檢測miR-21表達(dá)可為乳腺癌診斷與預(yù)后評估起到指導(dǎo)性作用。另外，本研究對侵襲性乳腺癌細(xì)胞應(yīng)用miR-21抑制劑后，侵襲性乳腺癌細(xì)胞遷移至小室細(xì)胞數(shù)量與穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)量均明顯低于正常乳腺組織，提示通過抑制miR-21表達(dá)能夠控制乳腺癌進(jìn)展。

綜上所述，乳腺癌患者的miR-21呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平同癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，抑制miR-21水平有利于控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

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湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南株洲 412000

【中圖分類號】R737.9

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.07.048