感染人乳頭狀瘤病毒的人喉咽鱗癌FaDu細胞系的建立

路武豪郭文濤馮 龍婁衛華*（ 鄭州大學第一附屬醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 45005； 廣東醫科大學基礎醫學院，廣東 東莞 5808； 河南中醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學科，河南 鄭州 450008）

感染人乳頭狀瘤病毒的人喉咽鱗癌FaDu細胞系的建立

路武豪1郭文濤2馮 龍3婁衛華1*
（1 鄭州大學第一附屬醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 450052；2 廣東醫科大學基礎醫學院，廣東 東莞 523808；3 河南中醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學科，河南 鄭州 450008）

目的 建立穩定感染人乳頭狀瘤病毒（HPV）陽性的人喉咽鱗癌FaDu細胞系，為體外研究下咽鱗癌提供理想的實驗模型。方法 重組HPV-16 E6-E7慢病毒，并用其感染人喉咽鱗癌FaDu細胞。RT-PCR和Western blot檢測慢病毒穩定感染的FaDu細胞E6、E7 mRNA和蛋白表達情況。結果 獲得穩定感染重組HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu細胞。結論 成功建立人乳頭狀瘤病毒感染的人喉咽鱗癌FaDu細胞系。

感染；人乳頭狀瘤病毒；人喉咽鱗癌；FaDu細胞

喉鱗癌和喉咽鱗癌是HNSCC中兩種常見惡性腫瘤，多發于中老年男性，大量抽煙和（或）飲酒是其公認的致癌因素，然而有一部分患者并無大量抽煙和（或）飲酒的病史，針對這部分患者的發病原因，研究者將目光轉向了HPV感染［1］。目前報道喉鱗癌HPV感染率的文獻很多，但鮮有喉咽鱗癌HPV感染情況的報道，HPV在喉咽鱗癌中的感染率及常見感染型別均不明確。為了便于體外深入研究HPV 感染的人喉咽鱗癌的發生、發展規律及HPV 與喉咽鱗癌演進的關系，我們運用慢病毒感染的方法建立了HPV陽性的人喉咽鱗癌細胞株，為體外研究喉咽鱗癌提供了理想的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 細胞株：人喉咽鱗癌FaDu細胞、人喉癌hep-2細胞和人胚腎細胞HEK293T細胞株均購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫。

1.2 制備重組HPV-16 E6-E7慢病毒：全基因合成HPV-16 E6-E7基因，并在兩端分別加上HindIII和KpnI限制性核酸內切酶位點，與慢病毒載體pLV-EGFP-C在T4連接酶的作用下連接，將連接體系轉化入DH5α感受態細菌，挑選長出的菌落進行測序鑒定，即得到重組HPV-16 E6-E7慢病毒。

1.3 細胞分組情況：細胞共分為3組：實驗組（重組HPV-16 E6-E7慢病毒穩定感染的FaDu細胞）、載體對照組（慢病毒空載體穩定感染的FaDu細胞）、空白對照組（未感染慢病毒的FaDu細胞）。

1.4 重組HPV-16 E6-E7慢病毒的包裝：提取HPV-16 E6-E7慢病毒質粒。將Polyfect-V轉染試劑和慢病毒質粒按照以下比例進行混合，轉染入293T細胞。轉染后48 h收集細胞培養上清，500 g離心10 min去除細胞碎片，進行病毒滴度測定，-80 ℃凍存。

1.5 E6、E7 DNA PCR檢測：參照QIAGEN公司基因組提取試劑盒提取慢病毒穩定感染人喉咽鱗癌FaDu細胞的基因組DNA。PCR擴增鑒定E6、E7 DNA存在情況。

1.6 RT-PCR檢測FaDu細胞中HPV-16 E6、E7 mRNA表達：Trizol法提取各組細胞總RNA，用AMV酶逆轉錄成cDNA，采用TaqMan探針熒光進行檢測各組細胞中E6/E7 mRNA表達水平。

2 結 果

2.1 重組HPV-16 E6-E7慢病毒的制備結果：重組HPV-16 E6-E7慢病毒測序結果與設計序列進行同源性比較分析，結果顯示目的DNA E6-E7序列在750～1000 bp靠近750 bp處有明亮條帶，與設計分子量一致。慢病毒滴度測定結果：重組HPV-16 E6-E7慢病毒滴度為1.15×108MOI，空載體慢病毒滴度為2.09×108MOI。

2.2 HPV-16 E6-E7 DNA已整合入FaDu細胞基因組：收集細胞（約5× 106）提取基因組DNA，E6和E7基因分別PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析照相，可見474 bp的HPV-16 E6 DNA條帶和297 bp的HPV-16 E7 DNA條帶，與設計完全一致，證實HPV-16 E6-E7 DNA已整合入FaDu細胞基因組。

2.3 慢病毒穩定感染FaDu細胞E6、E7 mRNA和蛋白均有高水平表達：重組HPV-16 E6-E7慢病毒感染FaDu細胞中可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP的表達。慢病毒穩定感染FaDu細胞E6、E7 mRNA和蛋白均有高水平表達，與已知整合有HPV的Hep-2細胞的表達水平一致，見圖1。

圖1 慢病毒穩定感染FaDu細胞中E6/E7表達水平均明顯升高（A.慢病毒感染的FaDu細胞中可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP的表達；B.慢病毒穩定感染FaDu細胞E6、E7 mRNA均有高水平表達，與已知整合有HPV的Hep-2細胞的表達水平一致；C.慢病毒穩定感染FaDu細胞與已知整合有HPV的Hep-2細胞均有明顯的E6、E7 蛋白印跡條帶，而空載體對照FaDu細胞、未轉染的FaDu細胞則無印跡出現）

3 討 論

本課題所建立的HPV陽性的人喉咽鱗癌系為從分子生物學水平探討人喉咽鱗癌的發病機制、治療及預防提供了理想的體外模型。目前的喉癌細胞株如Hep-2細胞系，來自于高加索黑人，為表皮樣癌，能夠檢測到HPV-18 DNA的存在。國內僅見1例喉癌細胞系建立的報道但其未進行HPV DNA的檢測［2］。

合適的載體是將HPV-16 E6-E7基因整合入FaDu細胞中的重要環節。慢病毒載體具有操作簡便、感染效率高、可感染細胞種類多、轉移基因片段容量大、作用穩定、安全性好等優點，是將基因整合入細胞的良好運載工具［3］。本課題通過全基因合成的方法合成HPV-16 E6和E7基因，在兩個基因中間插入一段編碼10個中性氨基酸的柔性鏈，以確保E6、E7基因在整合入宿主基因組后可以獨立表達E6、E7蛋白。將合成的目的基因與慢病毒載體pLV-EGFP-C重組后測序，結果顯示目的DNA E6-E7序列與設計序列完全一致，得到正確的重組慢病毒載體，對重組慢病毒載體進行包裝、滴度測定，獲得可用于轉染實驗的慢病毒載體。將帶有目的基因的慢病毒載體和空載體轉染入人喉咽鱗癌細胞FaDu細胞中，穩定培養，采用TaqMan探針熒光檢測法分別擴增E6、E7和內參β-actin，Western-blot檢測E6、E7蛋白，陰性對照為未轉染慢病毒載體的FaDu細胞，陽性對照為已知感染有高危型HPV的人喉癌Hep-2細胞，結果證實實驗組慢病毒載體成功將目的基因整合入FaDu細胞，并穩定表達E6、E7蛋白。

綜上所述，HPV陽性的FaDu細胞系的建立有助于研究HPV 感染的人喉咽鱗癌，并對深入研究HPV 與喉咽鱗癌的關系也具有重要意義。

［1]吳余，崔靜，王虹，等.HPV16相關宮頸癌組織中MUC16和E6表達的關系［J］.鄭州大學學報（醫學版），2015，50（1）: 41-44.

［2]蔡萍，吳展元，李金榮，等.人乳頭瘤病毒陰性的喉鱗癌細胞系的建立［J］.中華病理學雜志，2005，34（8）: 533-536.

［3]劉宏俠，吳蒙，孫玉滿，等.HPV感染及P53與CdC2蛋白表達對喉癌術后復發的預測價值［J］.中華腫瘤防治雜志，2015，22（7）: 519-523.

R739.6

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1671-8194（2016）18-0036-02

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