Tm值差異型不對稱PCR方法的建立及其在分子診斷中的應用

饒華春，滕繼云，刁　勇，宋沁馨，王立強，楊會勇*，周國華

(1.華僑大學 生物醫學學院分子藥物研究院，教育部分子藥物研究中心，福建泉州362021；2.南京軍區南京總醫院藥理科，江蘇南京210002；3.中國藥科大學 藥物分析教研室，藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇南京210009)

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Tm值差異型不對稱PCR方法的建立及其在分子診斷中的應用

饒華春1，滕繼云1，刁勇1，宋沁馨2,3，王立強1，楊會勇1*，周國華2*

(1.華僑大學 生物醫學學院分子藥物研究院，教育部分子藥物研究中心，福建泉州362021；2.南京軍區南京總醫院藥理科，江蘇南京210002；3.中國藥科大學 藥物分析教研室，藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇南京210009)

摘要：多數分子診斷方法對靶基因的檢測都是以單鏈DNA為基礎的，如何獲得大量和高質量的單鏈靶DNA分子一直是研究熱點.以包含BRCA1基因上3個單核苷酸多態性(SNP)的DNA片段為研究對象，通過調整不對稱擴增引物堿基序列組成(5′-端引入錯配或加入鎖核苷酸(locked nucleic acid，LNA))，使用相差10倍濃度來增加不對稱引物間Tm值差異，改進擴增條件(添加增強劑的擴增緩沖液，不同退火溫度的二階循環擴增程序)后，進行不對稱擴增來產生大量單鏈靶DNA產物.結果表明Tm差異型不對稱PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高單鏈DNA分子產率，降低引物設計難度，也擴大了模板序列的適用范圍.此外，還針對禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列進行不對稱擴增，用獲得的單鏈DNA為模板進行焦磷酸測序檢測，所得結果與參考序列一致且無明顯干擾信號.因此，采用Tm值差異型不對稱PCR可使焦磷酸測序等分子診斷流程更為簡便,成本更低,效率更高，具有很好的通用性和實用性.