欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子制備①

李英夫,宣兆博,王　鶴,廉曉宇

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

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欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子制備①

李英夫,宣兆博,王鶴,廉曉宇

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：分析β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子制備工藝的優化。方法：把聚氰基丙烯酸正丁酯作為載藥材料，以包封率為考察標準，借助界面縮聚法，并通過正交試驗和單因素實驗設計對制備工藝進行優化。結果：優化后的制備工藝所獲得的欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒大小均勻、形態規則、無黏連，平均包封率為90.17%，平均粒徑為260nm。結論：該優化方法切實可行，能有效提升欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備質量。

關鍵詞:欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯；包封率；正交試驗；納米粒

β-欖香烯是重要的抗癌單體，以抗癌中藥欖香烯揮發油作為生產原料，通過精餾純化等一系列工藝并去除δ、γ-欖香烯等成分獲得。應用于癌癥治療中，具有很高的選擇性，且能增強免疫作用、無肝腎毒、骨髓抑制等優勢，唯一的缺陷就是不良反應較高[1,2]。為降低其不良反應，并進一步提高其肝癌治療的療效，本實驗對藥物制備進行了優化，效果良好，現總結如下。

1儀器與試藥

1.1儀器

日本電子公式產JEOL JEM—1200EX 透射電鏡；高效液相色譜儀(Agilent 1100)；美國 PSS 粒度分析儀公司產；Nicomp 380ZLS激光粒度儀；臺式高速冷凍離心機(TGL—20M)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(85—1 型)。

1.2試藥

β-欖香烯原料藥(質量分數>98%)從大連遠大制藥有限公司購得；β-欖香烯對照品(質量分數>99%)，從南京森貝伽生物科技有限公司購得，批號為100268-200401；α-氰基丙烯酸正丁酯由浙江金鵬化工股份有限公司提供；泊洛沙姆 188EP標準品由法國蓋德化工產；右旋糖酐-70為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產；試劑純度要求：乙腈(色譜純)，其余均為分析純。

2方法

2.1單因素試驗

單因素實驗均在固定投藥量15 mg、BCA75μL、油水比 1︰2、pH 3.0、Poloxamer 188(40mg)與 Dextran-70(40mg)條件下進行[3]。(1)考察制備溫度，采用不同的制備溫度20℃、30℃、40℃，觀察其包封率結果無顯著變化，于是選擇室溫作為制備溫度；(2)考察制備時間，為提高包封率，在有機相與水相混合后常需要一段時間的攪拌，因此需考慮攪拌時間的影響。分別采用3、4、5h的攪拌時間觀察β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的包封率，結果顯示不同攪拌時間包封率無顯著差異(P>0.05)。可見攪拌時間對其包封率無顯著影響，且3h所得包封率較高，攪拌時間設置為3h；(3)pH會對包封率和界面聚合速度同時產生影響，以室溫為制備溫度，3h攪拌時間，并分別以2.0、3.0、4.0進行試驗，結果顯示pH3.0時，聚合速度和包封率最為理想，故水相pH值設置為3.0；(4)考察表面活性劑用量，制備溫度為常溫、3h攪拌時間、水相pH為3.0，考察Dextran-70和 Poloxamer188分別為30、40、50mg的包封率，結果顯示50mg時最大為90.1%，故設置選擇兩種表面活性劑各50mg[4]。

2.2制備過程的優化方法

(1)結合上述單因素實驗的結果，我們知道最佳的制備溫度、攪拌時間、水相pH值和表面活性劑用量，現對投藥量、油水比、轉速和BCA用量的最佳組合方式進行分析，依次設置A、B、C、D四個正交因子進行正交實驗，正交試驗設計表選擇為L9(34)[5]，對應的因素水平見表1。

表1 因素水平

表2　正交實驗設計和結果(n=3)

(2)常溫條件下，以BCA和β-欖香烯的丙酮溶液作為有機相，以Dextran-70和Poloxamer188各50mg用水溶解獲得水相，并用0.01mol/L標準鹽酸溶液將水相pH精準調節到3.0。通過一定轉速磁力攪拌作用，緩慢把有機相和水相按比例混合，3h的攪拌時間，隨后用NaOH溶液(0.01mol/L)調節pH值到7.0，攪拌0.5h用分液漏斗(G3)靜置，即可得β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的膠體溶液。以表-1因素水平，并按表2中正交實驗表完成實驗，見表2。

2.3確定包封率測定方法

(1)色譜條件，室溫條件下，乙腈-水為(90:10)，體積流量設置為(1.0mL/min)，以 Diamonsil TM C18(5μm，150mm×4.6mm)為色譜柱，設置210nm的檢測波長[6]。(2)線性關系考察，分別量取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL的β-ELE 對照品儲備液(0.896 mg/mL)，用甲醇稀釋后搖勻，分別精密吸取10μL的對照品儲備液，分別在液相色譜儀下觀測其峰值面積，并以峰值面積為y軸坐標，對照品的濃度為x軸坐標，做線性回歸分析，并對回歸方程進行計算。結果顯示，β-欖香烯線性關系最好的濃度范圍是(22.4～179.2)μg/mL。(3)空白對照試驗，按照上述優化后的制備方法進行操作，但制備過程中并不選擇加入β-欖香烯，從而制得空白納米粒，空白對照液的制備方法和供試品完全相同。分別精密吸取三種溶液10μL研究，分別為空白對照液、納米粒沉淀供試品溶液、納米粒對照品溶液，在相同的色譜條件下完成測量，測量結果顯示，在同等保留時間下的空白對照液并沒有出現峰值，因此排除其測定干擾[7]。(4)精密度實驗，選擇低、中、高3中對照品溶液，在1d重復5次進樣操作，計算1d內的精密度變化，結果顯示其RSD分別為0.64%、0.79%、0.91%，隨后測量其日間精密度，每天進樣一次，連續5d，測得RSD分別為0.82%、0.93%、1.82%。日間和日內精密度均較好。(5)穩定性實驗，選擇同一樣品均分為5份，每間隔2h進樣一次，分別測定其色譜峰面積，8h后所得RSD為1.27%，證明其在8h內穩定。(6)回收率實驗，選擇已經測定好的β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，精密測取6份5mL溶液，轉入10mL容量瓶中，均精密加入適量的β-欖香烯對照品溶液1.0mL，嚴格按照相同的制備步驟以及色譜條件下獲得制品并進樣，最后觀測并計算其回收率的均值。測得，β-欖香烯的回收率均值為96.7%，RSD則為1.7%，穩定性良好。(7)包封率測定方法，綜合分析選擇低溫超速離心的方法，精密測取1mLβ-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，轉入離心管中，轉速設置為18000r/min，低溫4℃，離心時間1.5h，去掉上清液，用適量的流動相將納米粒沉淀溶解，轉入10mL容量瓶，加流動相滴準，搖勻過濾，扔按上述色譜條件，獲取β-欖香烯實際藥物量(W1)。另精密測取1mLβ-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，轉入容量瓶(10mL)，加流動相滴準，搖勻濾過，與上述測定方法相同，測定藥物的總量(W0)，包封率計算方法為(W1/W0)，并對其進行方差分析，見表3。

表3　方差分析

3結果

3.1工藝驗證結果

為驗證優化后工藝質量，按照上述正交實驗所得的最佳工藝組合方式進行實驗，在同樣條件下分別制備3批β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯成品，測量其包封率，結果顯示3批成品包封率分別為90.2%、89.8%、90.3%，均值為90.1%，證明其工藝非常成熟。

3.2形態觀察和粒徑測定結果

按照上述所求最佳工藝制備條件制得β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯膠體溶液，將溶液稀釋并用磷鎢酸(1.5%)染色后采用透射電鏡對其形態進行觀測，電鏡結果顯示，制品中納米粒大小均勻，有規整的形態，且無黏連。采用激光粒度分析儀測量其粒徑均值，結果粒徑均值為260nm。

4討論

在制藥工藝中，納米粒形態的藥物制備方法主要有界面縮聚法和乳化聚合法，由于β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的原料藥為β-欖香烯，其為一種揮發性強的脂溶性油類，因此不宜選擇乳化聚合法。常規的方法是將BCA和β-欖香烯溶解在有機溶劑中，并作為油相與水相緩慢混合，音α-BCA中含有βC+，因此可與水中的OH-離子發生聚合反應，從而包裹β-欖香烯獲得納米粒。為包封率的影響因素主要為聚合反應速度、pH值、油水比例等。本文結合單因素實驗和正交試驗設計對其制備工藝進行了優化，并進行了實驗室驗證，結果顯示優化后的制備方法實際可行，制得納米粒均勻、平整，且粒徑滿足要求。

參考文獻：

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[3]袁子民,王靜,王博,等. β-欖香烯聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒凍干粉針的制備及理化性質研究[J]. 時珍國醫國藥,2013,3:650-651

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[6]陳貴起,段鳳英. 我國納米粒藥物制劑的研究現狀[J]. 天津藥學,2009,2:50-52

[7]徐巍,鄧樹海,李艷輝. 大蒜素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備工藝研究[J]. 中國新藥雜志,2006,6:448-451

基金項目：①黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201369。

作者簡介：李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫師。

中圖分類號：R284

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)03-0100-02

(收稿日期：2016-03-07)