左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中Syt1和PSD95表達的影響①

王　禹，王海燕，王　婧，趙冬梅，趙塔娜，聶　磊，馮宏達

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內二科，黑龍江 佳木斯 154003)

?

左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中Syt1和PSD95表達的影響①

王禹，王海燕，王婧，趙冬梅，趙塔娜，聶磊，馮宏達

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討抗癲癇藥物左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中的突觸囊泡膜蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ,Syt1)和突觸后致密物(PSD95)表達的影響。方法: 隨機將清結級Wistar雄性4周齡幼鼠84只,分為A、B、C組。A組：生理鹽水對照組 ，B組：模型組(Li-pilo組)，C組：治療組(LEV治療組) ，其中A組24只，B、C兩組組每組各30只。分組后分別給予造模，造模成功后，給予C組以LEV150mg/kg灌胃給藥每日一次，連續4周。采用免疫組化方法分別在1周、2周和4周動態檢測3組大鼠海馬組織中Syt1和PSD95的表達。結果：B、C 兩組均出現癲癇樣發作。左乙拉西坦對照組組與生理鹽水對照組相比，Syt1和PSD95 各表達量的差異均無統計學意義；B組的Syt1 的表達量明顯升高，PSD95的表達明顯減少，與A組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；C組與B組相比，Syt1的表達量明顯降低而PSD95的表達有所增加，各組差異均有統計學意義(P<0.05)。結論:癲癇反復發作后可能誘導 Syt1表達增強，Syt1可能通過增加興奮性神經遞質的釋放進一步促進癲癇發生。癲癇大鼠海馬組織中PSD95的表達水平明顯下降，左乙拉西坦能增強癲癇大鼠海馬組織中PSD95的表達。

關鍵詞：左乙拉西坦；癲癇 ； 突觸囊泡膜蛋白Ⅰ；突出后致密物；大鼠海馬

神經元間信號傳遞主要是通過突觸間的相互傳遞。突觸間的傳遞異常可造成腦細胞群出現異常的放電，即可引起癲癇發作，可產生突然的、短暫的腦功能障礙。由于兒童與成人不同，腦組織等尚未發育健全，故較成人更易發生癲癇。而反復發作的癲癇更可影響中樞神經系統的發育[1]。Syt1又叫突觸結合蛋白-1，是中樞神經系統內突觸囊泡特有的膜的內在蛋白質, 其位置位于突觸前膜。是最主要的Ca2+感受器之一，在調節突觸傳遞方面起到重要作用。有實驗表明[2]，在癲癇大鼠海馬組織中Syt-1可以通過調節谷氨酸(Glu)等神經遞質的釋放進一步影響神經突觸可塑性,從而引發癲癇發生。PSD95是一種位于突觸后膜的蛋白-蛋白復合體，它能整合信號分子、調節分子和靶分子在突觸后膜[3]，促進突觸可塑性,而突觸可塑性和結構的改變是異常放電反復發生的的基本原因[4]。左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)是一種新型廣譜抗癲癇藥物，已有研究表明其與突觸囊泡有關。

1材料與方法

1.1實驗動物分組

選用84只清潔級的Wistar大鼠(佳木斯大學動物實驗室提供)，體重均在(90±10)g，隨機分為3組，用記號筆標注。A組：生理鹽水對照組 ，B組：模型組(Li-pilo組)，C組：治療組(LEV治療組) ，其中A組24只，B、C兩組組每組各30只。

1.2實驗試劑

主要試劑有: 氯化鋰 (上海寶泰生物科技公司)、匹羅卡品(德國Sig公司)、左乙拉西坦片(UCB Pharma 比利時)、兔抗大鼠Syt1抗體(上海寶泰生物科技有限公司)、兔抗大鼠PSD95抗體(上海寶泰生物科技有限公司)。

1.3動物模型的制備

參照相關文獻[5]建立動物模型，給予B、C兩組按氯化鋰腹腔注射按100mg/kg計算，再于20h后，給予東莨菪堿腹腔注射按l.0mg/kg計算，再于30min后給予腹腔注射匹羅卡品按80mg/kg計算，同時觀察大鼠癲癇發作情況。參照癲癇發作RACINE等級分級。0級:大鼠表現無反應或抽搐停止;1級:大鼠的嘴和面部出現節律性抽動;2級:大鼠可出現點頭或甩尾;3級:大鼠單側肢體抽動;4級:大鼠多肢抽動或強直;5級:全面性強直陣攣發作甚至不自主跌倒。選擇出現4級或以上發作的大鼠，且發作持續30min后再給予地西泮10mg/kg腹腔注射終止發作。選擇各組符合條件的鼠每組各24只，C組在成功造模24h后給予左乙拉西坦200mg/kg灌胃，其他兩組則給予相同劑量的生理鹽水灌胃，均為每日一次，連續4周，動態觀察，并分別于第1周、2周、4周提取海馬組織于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4應用免疫組化方法檢測大鼠海馬組織中Syt1和PSD-95的表達水平

先將甲醛溶液中的海馬組織取出并置20%蔗糖溶液(4℃)中24h。將海馬組織取出并通過石蠟包埋切片進行免疫組化染色。

按照說明進行免疫組化染色，按照脫蠟水化—抗原修復—血清封閉—滴加一抗—滴加二抗—復染—脫水后充分晾干后中性樹膠封片的步驟逐一操作。 在顯微鏡鏡下(X400)觀察每張切片免疫組化

染色后海馬陽性細胞數，隨機選取5個視野計數陽性細胞數，取其平均值。

1.5統計學方法

2結果

2.1觀察動物的行為學表現

在腹腔注射匹羅卡品約10min后B組和C組大鼠均出現0～5級等不同程度的癲癇發作，甚至全面性強直陣攣發作。給予止抽后再給予LEV200mg/kg每日一次灌胃，發現C組與B組大鼠比較，癲癇發作的程度及次數均明顯減少。

2.2Syt1免疫組化結果

免疫反應產物主要分布在海馬區，呈棕黃色圓形或橢圓形。與A組比較，B組大鼠海馬中的Syt1免疫反應的陽性細胞數增多(P<0.05)，PSD-95免疫反應的陽性細胞數減少(P<0.05)，差異有統計學意義；與B組比較，各時間點C組海馬組織中Syt1表達減少(P<0.05)而PSD-95表達減少(P<0.05)，差異有統計學意義。見表1～2。

表1　各組大鼠海馬組織中Syt1陽性細胞數比較±s，n=8)

注：ΔLEV組與NS組比較：P>0.05；*Li-PILO與NS組比較：P<0.05；※LEV治療組與Li-PILO組比較：P<0.05。

表2　各組大鼠海馬組織中PSD-95陽性細胞數比較±s，n=8)

注：ΔLEV對照組與NS組比較：P>0.05；*Li-PILO與NS組比較：P<0.05；※LEV治療組與Li-PILO組比較：P<0.05。

3討論

癲癇是由于突觸間的傳遞異常可造成腦細胞群出現異常的放電[6]。兒童處于生長發育期，神經系統尚未發育健全，長期反復的癲癇發作可嚴重影響其日后生長發育及生活質量。癲癇可造成神經元損傷，進而導致腦組織損傷甚至是永久性的損害。區別于傳統抗癲癇藥物，新一代左乙拉西坦(LEV)，是通過多種機制發揮作用。研究表明[7]，在匹羅卡品誘發的癲癇大鼠中，LEV能明顯減少海馬神經細胞的死亡，具有神經保護作用，對神經元突觸重建有著重要的影響。通過本次實驗我們發現，模型組中大鼠海馬組織中Syt1的細胞數表達明顯高于鹽水對照組，而經LEV治療組中海馬組織中Syt1的表達水平與模型組比較明顯降低。由此可推測，LEV可以通過控制癲癇發作，減少突出囊泡的循環，減輕突觸損害的程度，進而抑制癲癇大鼠海馬組織中Syt1的表達和減輕PSD-95的降低程度，在影響突觸囊泡、Ca2+和興奮性神經遞質等在異常突觸間的轉運發揮其抗癲癇作用。

參考文獻:

[1]王海燕，王影，聶磊，等.左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013,36(3):6-8

[2]Burkhardt C, Muller M, Badde A, et al. Semaphorin 4B interacts with thepost-synaptic density protein PSD-95/SAP90 and is recruited to synapses through C-terminal PDZ-binding motif[J]. FEBS-Lett, 2005, 579(17): 3821-3828

[3]王海燕，胡云秋，劉杰薇.左乙拉西坦對海人酸致癇大鼠血清NSE和MBP變化的影響[J].黑龍江醫藥科學，2012,35(4):2-3

[4]Lynch BA, Lambeng N, Nocka K,et al.The synaptic vesicle protein SV2A is thebinding site for the antiepileptic drug levetiracetam[J]. Proc NatlAcad SciU SA, 2004, 101 (26): 9861-9866

[5]Aarts MM , Tymianski M. Molecular Mechanisms Underlying Specificity ofExcitotoxic Signaling in Neurons[J]. Curr-Mol-Med, 2004, 4(2):137-147

[6]Angela FL, JoseLuisSC, MariCI, et al.Caloric restiction increases learning consolidation and facilitates synaptic plasticity through mechanisms dependent on NR2B subunits of the NMDA receptor[J]. JNeurosci，2007,27(38):10185-10195

[7]Yan XB, Song B, Zhang GY. Postsynaptic density protein 95 mediatesCa2+/calmodulin-dependent protein kinase II-activated serine phosphorylation ofneuronal nitric oxide synthase during brain ischemia in rat hippocampus[J].Neurosci Lett,2004,355(3):197-200

基金項目：①黑龍江省衛生計生委科研課題，編號：2014-225。

作者簡介：王禹(1968～)男,黑龍江佳木斯人,學士，副主任醫師。

中圖分類號:R742.1

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0014-02

(收稿日期：2016-01-21)