紫花苜蓿總黃酮對LPS誘導乳腺上皮細胞炎性因子的抑制作用①

劉立新，張羽男，張　磊，郭映雪，沈　宇，張云杰

(黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

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紫花苜蓿總黃酮對LPS誘導乳腺上皮細胞炎性因子的抑制作用①

劉立新，張羽男，張磊，郭映雪，沈宇，張云杰

(黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

摘要:目的：研究紫花苜蓿總黃酮對LPS誘導小鼠乳腺上皮細胞炎癥反應的抑制作用及機理。方法：1 μg/mL LPS刺激細胞之前，分別用50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL紫花苜蓿總黃酮預先處理細胞1.5h；采用MTT法測定細胞的活性；分別利用qRT-PCR法和Western boltting法檢測炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA表達和NF-κBp56蛋白表達。結果：紫花苜蓿總黃酮可以抑制NF-κB核轉位，降低TNF-α和IL-6 mRNA的表達量，提高細胞的活力。結論：紫花苜蓿總黃酮可以通過下調NF-κB信號通路抑制炎性因子的產(chǎn)生。

關鍵詞：紫花苜蓿總黃酮；LPS；乳腺上皮細胞；抑制作用

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽，是廣泛應用于奶牛飼料的一種產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高、適口性好的牧草，用紫花苜蓿飼喂奶牛可以提高牛奶的產(chǎn)量和品質[1]。黃酮為紫花苜蓿中主要的生物活性成分之一，其具有增強機體免疫力、抗菌、抗腫瘤、延緩衰老等作用[2]。本實驗用LPS誘導小鼠乳腺上皮細胞建立炎癥模型，從分子角度研究紫花苜蓿總黃酮的抗炎作用以及炎癥反應信號通路調節(jié)方面的抗炎機理，為紫花苜蓿總黃酮深入研究和奶牛乳腺炎防治，提供了基礎參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料、試劑和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

清潔級昆明小白鼠，由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.1.2藥物

LPS(Escherichia coli 0111:B4)(Sigma公司)；紫花苜蓿總黃酮由佳木斯大學天然藥物化學實驗室提供。

1.1.3試劑

優(yōu)質胎牛血清(FBS)(Sigma公司)，DMEM/F12干粉(Sigma公司)，Trizol (Invitrogen 公司)，MTT(sigma公司)，NF-κBp65抗體(Santa Cruz)，SYBR?Primx ExTaqTM(TaKaRa)，Prime ScriptTMRT reagent Kit(大連寶生物)。

1.1.4儀器

Sunrise-Basic酶標分析儀(瑞士Tecan)，CKX41(光學顯微鏡日本 Olypus)，SW-CJ-IFD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，7300 Real-Time PCR System(美國Applied Biosystems)，F(xiàn)orma3111 Series2 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Electron)。

1.2方法

1.2.1小鼠乳腺上皮細胞的分離和培養(yǎng)

小鼠乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)方法參照王楠楠等的方法[3]稍加改良，以下操作均在超凈工作臺中進行。具體步驟如下: (1)采集產(chǎn)仔5d后小鼠的乳腺實質部分，用含有雙抗的D-Hank’s緩沖液反復清洗；(2)去除淋巴結和結締組織，在小燒杯中將乳腺組織剪成約1mm3的小塊，再用D-Hank's緩沖液反復清洗；(3)加入與組織比例為3:1左右的消化液37℃消化2～3h；(4)用200目銅網(wǎng)過濾，將過濾后的細胞液2000rpm離心15min，收集細胞；(5)加入細胞洗液洗8～10次，每次1000r/min離心1min，去除成纖維細胞；(6)加入含有10% FBS和雙抗的細胞培養(yǎng)液轉移到新的細胞瓶中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(7)培養(yǎng)2～3d后，吸棄上清液，加入新鮮的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組

將實驗分成5組：空白對照組：正常培養(yǎng)的小鼠乳腺上皮細胞；LPS組陽性對照組：正常培養(yǎng)的小鼠乳腺上皮細胞用含1μg/mL LPS的細胞培養(yǎng)液處理；紫花苜蓿總黃酮低劑量組：正常培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細胞用含有50μg/mL的紫花苜蓿總黃酮處理1.5h后，用含1μg/mL LPS的細胞培養(yǎng)液處理；紫花苜蓿總黃酮中劑量組：正常培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細胞用含有100μg/mL的紫花苜蓿總黃酮處理1.5h后，用含1μg/mL LPS的細胞培養(yǎng)液處理；紫花苜蓿總黃酮高劑量組：正常培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細胞用含有200μg/mL的紫花苜蓿總黃酮處理1.5h后，用含1μg/mL LPS的細胞培養(yǎng)液處理。每組設3個重復。

1.2.3細胞活性的檢測

將長勢良好的小鼠乳腺上皮細胞以適宜的濃度接種于96孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞至生長密度為80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，然后加入含紫花苜蓿總黃酮終濃度為50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的細胞培養(yǎng)液，作用1.5h后加入終濃度為1μg/mL的LPS進行刺激，同時設立空白對照組和LPS陽性對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入終濃度為0.5μg/mL 的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h后，棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，振蕩10min ，充分溶解結晶物，用酶標儀于492nm波長下測定吸光值，計算相對細胞存活率。

1.2.4細胞因子mRNA水平檢測

將生長良好的小鼠乳腺上皮細胞接種到6孔板中，待細胞密度達90%左右時，按1.2.2方法對實驗細胞分組并給藥處理，LPS刺激培養(yǎng)12h后收集各組細胞，提取總RNA，具體方法參照：每孔加入1mL Trizol，充分裂解細胞，然后將細胞液轉移至離心管中，靜置5min后每管分別加入200μL氯仿，振蕩后室溫靜置2～3min；12000r/min、4℃離心10min，吸取上層水相至新離心管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置5min；12000r/min、4℃離心10min，留下沉淀；75%乙醇清洗沉淀；12000r/min、4℃離心5 min，棄上清得總RNA沉淀物，用紫外分光光度計測其純度。將提取的細胞總RNA反轉錄成cDNA，以β-Actin為內參基因，采用qRT-PCR法檢測TNF-α，IL-6 mRNA的表達情況。TNF-α的引物序列：Sense：5' GGCGGTGCCTATGTCTCA 3'，Anti-sense： 5' GGCAGCCTTGTCCCTTGA 3'；IL-6的引物序列：Sense 5' TATGGAATAAGGCTGCTATGAA 3'，Anti-sense 5' TGGTAAGGATGTGGAGAA 3'；β-actin的引物序列：Sense 5' TATGAATAAGGCTGCTATGAA 3'，Anti-sense 5' TGGTAAGGATGTGGAGAA 3'。具體反應條件為：95℃，10 s預變性。95℃，5s；60℃，31 s；共計循環(huán)40次。qRT-PCR所測得各基因的CT值同內參基因β-actin的CT值相比較，計算該基因的相對表達量，所用計算公式為：相對表達量=2-ΔΔCT 。每個樣本至少設立3個平行樣。

1.2.5NF-κB p65蛋白水平檢測

將生長良好的小鼠乳腺上皮細胞接種到6孔板中，待細胞密度達90%左右時，按1.2.2方法對實驗細胞分組并給藥處理，LPS刺激培養(yǎng)12h后收集各組細胞，提取核蛋白，具體方法參照[4]，采用Western boltting方法檢測各組核蛋白的NF-κB p65蛋白表達量的變化。將樣品在SDS-PAG中電泳(濃縮膠80V；分離膠120V)1.5h后，利用半干轉移電泳儀，將凝膠上的蛋白帶電轉移到硝酸纖維素膜上(NC)，5%脫脂乳封閉1.5h后，TBS洗滌3次，每次10～15min，于一抗工作液(稀釋比例1：1000)

中孵育過夜，用辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(稀釋比例1：2000)孵育1.5h。TBS洗滌3次，超敏發(fā)光液顯光， Xz一片感光后，顯影定影，Tanon 1600R全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白表達量。β-actin 蛋白作為內參蛋白，蛋白的灰度比值來表示目的蛋白的相對表達量。

2結果

2.1紫花苜蓿總黃酮對小鼠乳腺上皮細胞活性的影響

采用MTT法檢測紫花苜蓿總黃酮對小鼠乳腺上皮細胞活性的影響，見圖1，與空白對照組相比，單獨用LPS處理細胞后，細胞活性顯著下降(P<0.01)；與LPS對照組相比，用不同濃度紫花苜蓿總黃酮預處理的細胞均能顯著或極顯著地提高小鼠乳腺上皮細胞的活性(P<0.01，P<0.05)，并且劑量越大效果越明顯，結果表明，紫花苜蓿總黃酮能增加LPS誘導的小鼠乳腺上皮細胞的活性。

注：與空白對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS處理組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1紫花苜蓿總黃酮對小鼠乳腺上皮細胞活性的影響

2.2紫花苜蓿總黃酮對TNF-α和IL-6 mRNA表達的影響

采用qRT-PCR法檢測各組細胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表達情況，見圖2，與空白對照組相比，在LPS作用下細胞TNF-α和IL-6的mRNA表達量極顯著升高(P<0.01)；加入紫花苜蓿總黃酮干預后再用LPS刺激后，TNF-α和IL-6的mRNA表達被有效地抑制了，并且加入100μg/mL和200μg/mL紫花苜蓿總黃酮組與LPS陽性對照組相比差異極顯著(P<0.01)。結果表明，紫花苜蓿總黃酮可以有效地抑制LPS誘導的炎性因子TNF-α和IL-6、的mRNA表達。

注：與空白對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS處理組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3紫花苜蓿總黃酮對NF-κB p65蛋白表達的影響

采用Western blotting法檢測每組細胞中NF-κB p65蛋白的表達情況，見圖3，與空白對照組相比，單獨用LPS刺激細胞，NF-κB核轉位程度增強，即細胞核內NF-κB p65的含量增加；用紫花苜蓿總黃酮預先處理再用LPS刺激后，細胞核內NF-κB p65的含量降低了，與LPS陽性對照組相比，50μg/mL 紫花苜蓿總黃酮組顯著抑制NF-κB核轉位(P<0.05)，100μg/mL和200μg/mL紫花苜蓿總黃酮組極顯著抑制NF-κB核轉位(P<0.01)。結果表明，紫花苜蓿總黃酮抑制了細胞中NF-κB的核轉位。

注：與空白對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS處理組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖3紫花苜蓿總黃酮對NF-κB p65蛋白表達的影響

3討論

乳腺炎是哺乳動物常見的一種乳腺疾病，嚴重威脅著母體和后代的健康。其中奶牛乳腺炎的發(fā)病率極高，全世約有30%左右的奶牛患有各種類型的乳腺炎[5]，從而導致奶產(chǎn)量和品質的下降，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來高額的經(jīng)濟損失[6]。引起乳腺炎發(fā)生的原因有多種，其中生物因素占主導地位，包括：球菌、桿菌、真菌、支原體、酵母菌等各種病原微生物。有報道稱，在患乳房炎的奶牛乳汁中有TNF-α、IL-1β和IL-6的增加，提示這些細胞因子在乳腺炎癥反應過程中的起著重要作用[7]。NF-κB是真核細胞轉錄因子Rel家族成員之一，是多種信號傳導通路的聚集點，在調節(jié)炎癥和對外來刺激免疫應答方面起著重要作用，NF-κB被激活后進入細胞核內與靶基因上的特定位點結合，發(fā)揮轉錄調控作用從而導致大量具有致熱活性炎性因子的合成和釋放，主要有TNF-α、IL-1β、IL-6等[8, 9]。

本研究通過檢測紫花苜蓿總黃酮對小鼠乳腺上皮細胞NF-κB信號及TNF-α、IL-6的影響，從抗炎角度探討紫花苜蓿總黃酮的作用機理。實驗結果發(fā)現(xiàn)，LPS可以激活小鼠乳腺上皮細胞的NF-κB信號通路，導致NF-κB發(fā)生核轉位，誘導大量TNF-α和IL-6炎癥因子產(chǎn)生，導致細胞活性降低。而再LPS刺激前，用紫花苜蓿總黃酮預先處理細胞可以抑制NF-κB進入，抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達，從而增加細胞的活性。該實驗結果表明紫花苜蓿總黃酮能抑制乳腺炎癥反應的發(fā)生。

參考文獻：

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[2]朱見明,李娜,張亞軍,等. 苜蓿黃酮的研究進展[J].草業(yè)科學,2009,26(9):156-162

[3]王楠楠,丁云磊,周維,等. CpG-ODN對LPS誘導的大鼠乳腺上皮細胞損傷的保護作用[J].江蘇農業(yè)科學,2011,39(3):247-249

[4]Li S, Wang W, Fu S, et al. IL-21 Modulates Release of Proinflammatory Cytokines in LPS-Stimulated Macrophages through Distinct Signaling Pathways[J]. Mediators of Inflammation 2013,2013:1-12

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[9]Jiang J X, Zhang Y, Ji S H, et al. Kinetics of mitogen-activated protein kinase family in lipopolysaccharide-stimulated mouse Kupffer cells and their role in cytokine production[J]. Shock, 2002, 18(4): 336-341

基金項目：①1.國家自然基金項目，編號：31101250；2.中國博士后科學基金項目，編號：2014M561382。

作者簡介：劉立新(1978～)女，黑龍江佳木斯人，在讀博士，講師。

中圖分類號：R322.6+6

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0001-03

(收稿日期：2016-03-09)

The inhibition effect of total flavonoids of alfalfa on inflammatory cytokines in LPS-induced mammary epithelial cell

LIULi-xin,ZHANGYu-nan,ZHANGLei,GUOYing-xue,SHENYu,ZHANGYun-jie

(The Key Laboratory of Biological Drug Affiliated to Heilongjiang Education Authority, College of Pharmacy in Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract:Objective: To study the inhibition effects of total flavonoids of alfalfa on inflammatory cytokines and mechanism. Methods: Before the cells were stimulated with 1 μg/mL LPS, the cells were treated with 50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL total flavonoids of alfalfa for 1.5 hours. The expression levels of TNF-α, IL-6 mRNA and NF-κBp56 protein were determined by qRT-PCR method and Western boltting method respectively. Result: Total flavonoids of alfalfa could inhibit NF-κB nuclear translocation; reduce the expression levels of TNF-a and IL-6 mRNA; and improve cells vitality. Conclusion: Total flavonoids of alfalfa can inhibit the production of inflammatory cytokines by reducing NF-κB signaling pathway.

Key words:total flavonoids of alfalfa; LPS; mammary epithelial cell; inhibition effect