烤煙青枯病田間發生動態及其與氣象因素的相關性

林　勇，徐　茜，陳志厚，孔凡玉，白萬明*

（1.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000；2.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

烤煙青枯病田間發生動態及其與氣象因素的相關性

林勇1,2，徐茜1，陳志厚1，孔凡玉2，白萬明1*

（1.福建省煙草公司南平市公司，福建 南平 353000；2.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點實驗室，青島 266101）

2013—2014年對南平建陽煙田土壤青枯病菌數量和發病情況進行了系統調查，分析了病害與主要氣象因子的相關性。結果表明，SMSA半選擇性培養分離法和熒光定量PCR法均能有效檢測土壤中青枯病菌，前者檢測的青枯病菌數量與病情指數相關性（R2=0.8191）高于后者（R2=0.7464）?？諝鉁囟取穸取⒔邓腿照諘r數等氣象因子中，溫度是影響南平煙田青枯病菌數量和發病程度的關鍵氣象因子。5月下旬至6月初，周平均溫度高于22℃時，病害進入始發期，此時根際土壤中病菌數量高于5.0×105cfu/mL。6月上旬至中旬，周平均溫度在22～25℃，病害處于平穩發展期，青枯病菌數量在1.0×105～2.2×106cfu/g。6月中下旬，周平均氣溫高于25℃，病害進入爆發期，青枯病菌數量在2.2×106cfu/g以上。溫度對于指導青枯病的預測預報和防治具有重要價值。

煙草；青枯病；氣象因子；相關性；南平

煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起[1]的一種毀滅性病害，在南平煙區煙葉成熟期為害嚴重，具有發病急、傳播快、難控制等特點。煙草青枯病菌寄主范圍廣[2]，具有豐富的生物多樣性[3-5]，能夠以腐生或寄生的方式在土壤中存活多年。當條件適宜時病原物通過根部傷口或次生根萌發點侵染植株[6-7]。正是由于該病菌的上述特點，煙草青枯病得以大面積流行。為了有效控制該病害，摸清南平煙區青枯病田間發生和流行規律，本研究通過定點系統調查，研究了南平煙區青枯病菌和病害消長動態及其與氣象因子的相關性，以期為南平煙區青枯病的防治提供依據。

1　材料與方法

1.1病害系統調查

2013—2014年系統調查地點設在福建省南平市建陽莒口煙田，調查田塊常年發病。試驗地土壤類型為紅壤，土壤肥力中等，前茬作物均為水稻，調查品種為當地主栽品種K326，調査地塊煙草的整個生育期未噴施化學藥劑。移栽后至采烤基本結束每周調查一次病情指數，記錄田間首次發現病株時間。病害調查時，將調查田塊分成3個小區，每個小區采用五點取樣法定時定株調查，每個調查點調查10株，病情指數計算參照文獻[8]的方法。調查田塊2013年和2014年煙草移栽時間分別為3月8日和3月14日，為便于分析，對兩年度3月20日至6月22日調查和取樣數據進行統計。

1.2土壤樣品采集方法

煙草根際土的采集參照文獻[9]方法進行。移栽后1周開始取樣，每個小區利用五點取樣法取5株煙根際混合土樣100 g。取樣后-20℃保存，盡快帶回實驗室處理。

1.3青枯病菌分離

采用SMSA半選擇性培養基[10]分離根際土壤中的茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）。土壤樣品用無菌水進行梯度稀釋，涂布SMSA平板計數，28℃培養2 d后，統計具有青枯菌特點的菌落（流動，平滑，帶有乳白色暈圈的粉紅色菌落，底部呈馬蹄形）。

1.4青枯病菌RT-PCR檢測

按照操作說明，用試劑盒（Ultra Clean DNA Isolation kit，MOBIO）提取和純化土壤DNA。參照陳巧玲方法[11]進行青枯病菌RT-PCR檢測。將純化的土壤樣品DNA為模板，擴增反應體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5mmol/l)2 μL、引物（10 mmol/L）1 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL，rTaq DNA 酶0.3 μL，DNA模板1μL，ddH2O補足至25μL。根據已報道的青枯菌fliC基因設計并合成引物f：-GAACGCCAACGGTGCGAACT，r：5?-GTGGGG TTCGCCTGATTTT-3?。反應參數：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共30次循環；72℃ 10 min。獲得擴增曲線、標準曲線和熔解曲線，計算樣品初始基因拷貝數，換算每克樣品的基因拷貝數。

1.5氣象資料獲取

溫度、降雨、日照時數和相對濕度等氣象資料均采用建陽市氣象站數據。

2　結果

2.1煙草根際青枯病菌群消長動態

如圖1所示，SMSA半選擇培養基法和RT-PCR法均能有效檢出煙草根際土壤中青枯菌。RT-PCR法檢測限低，在土壤中青枯菌含量1000 cfu/g時即可檢出，因此檢出時間較SMSA培養法早7～14 d。SMSA半選擇性培養分離法檢測青枯病菌數量與病情指數相關性（R2=0.8191）高于熒光定量PCR法(R2=0.7464)。兩種方法均具有較好的相關性（2013年和2014年R2值分別為0.9958和0.9742），說明檢測結果較為可靠。在莒口煙田煙草根際土壤青枯病菌的生物量測定中，SMSA平板檢測和RT-PCR檢測青枯病原菌數量發生趨勢基本一致。移栽后1個月（4月上旬），青枯菌開始少量檢出。雖然2013年移栽較2014年早7 d，但2014年青枯菌的初次檢出時間比2013年早7～14 d。4月中旬至5月中旬為病原菌積累期，青枯菌數量緩慢增長。5月下旬至6月下旬屬于病原菌爆發期，煙草根際土壤青枯菌數量急劇增加。

圖1　煙草根際土壤青枯菌群密度Fig.1　Population density of R.solanacearum in tobacco rhizospheric soil

2.2煙草青枯病田間消長動態

從連續2年的調查結果來看（圖2），南平煙草青枯病發生發展具有發病急、流行快的特點。2013年和2014年田間病株初次發現時間分別為6月3日和5月28日，說明5月底至6月初為病害的始發期。6月上旬至中旬為病害快速發展期，病情指數在10以下。6月中旬至下旬為病害爆發流行期，病情指數快速上升至30以上，田間危害嚴重。從年度間發病情況來看，青枯病2014年較2013年發病早、危害重。

圖2　煙草青枯病病情指數動態變化Fig.2　Disease index of tobacco infected by R.solanacearum

2.3青枯病發生與青枯菌數量的關系

煙草青枯病發生與根際土壤青枯菌數量呈正相關。利用SMSA培養基和RT-PCR檢測方法，青枯菌數量與病情指數的R2值分別為0.8191（圖3）和0.7464（圖4）。煙草青枯病田間初次發病時，煙株根際土壤病菌檢出數量2013年為2.5～5.0×105cfu/mL，2014年為2.7～5.2×105cfu/mL。

2.4青枯菌數量與氣象因素的關系

圖3　SMSA培養基檢測青枯菌數量與病指相關性Fig.3　Correlation between population of R.solanacearum detected by SMSA and disease index

圖4　RT-PCR檢測青枯菌數量與病指相關性Fig.4　Correlation between population of R.solanacearum detected by RT-PCR and disease index

表1　南平建陽市2013和2014年主要氣象因子數據Table 1　Meteorological data in Jianyang of Nanping between 2013 and 2014

煙草青枯病試驗取樣與調查期間建陽市氣象數據如表1所示。以SMSA培養基檢測青枯病菌數量為因變量（Y），周平均日照時數（X1）、周平均氣溫（X2）、周平均相對濕度（X3）和周平均降水量（X4）為自變量，通過逐步回歸分析方法建立方程Y=-753.748699+0.27723384829X1+25.024981268X2+3.555471505X3-0.14285654450X4， 相 關 系 數r=0.7840。如表2所示，煙草根際青枯病菌數量與周平均日照時數、周平均氣溫、周平均相對濕度和周平均降水量呈正相關。偏相關分析結果表明，周平均溫度偏相關系數最大（0.7465），說明溫度可能是青枯病菌數量的關鍵影響因子。通徑分析的決定系數R2=0.6143，剩余通徑系數為0.6208，說明上述4個氣象因子對煙草青枯病菌數量影響的比重達62.08%。

2.5青枯病病情指數與氣象因素的關系

以煙草青枯病病情指數為因變量（Y），周平均日照時數（X1）、周平均氣溫（X2）、周平均相對濕度（X3）和周平均降水量（X4）為自變量，通過逐步回歸分 析 方法建立方程 Y=-331.134402-0.3915367684X1+10.935617168X2+0.9093703211X3+ 0.05259075419X4，相關系數r=0.906481。煙草根際青枯病菌數量與周平均氣溫和周平均降水量呈正相關。周平均溫度偏相關系數最大（0.7465），其次為周平均降水量（0.5234），說明溫度和降水是病害發生的關鍵影響因子。通徑分析的決定系數R2=0.8217，剩余通徑系數為0.4223，說明上述4個氣象因子對煙草青枯病菌數量影響的比重達82.17%。

表2　青枯病菌與主要氣象因素相關性分析Table 2　Correlation between R.solanacearum and meteorological factors

表3　影響煙草青枯病菌數量和病情指數的主要氣象因子通徑分析Table 3　Path analysis of climatic factors on pathogen population and disease index

3　討論

青枯菌為土壤習居菌，在植物發病以前已經在土壤中開始大量積累。平板劃線分離法是目前檢測土壤中青枯菌數量最常用的方法，培養基主要為紅四氮唑非選擇培養基（TZC）[12]和改良SMSA半選擇培養基[13]。近年來快速發展的熒光定量PCR技術開始廣泛用于植物青枯菌檢測[14-16]。本研究分別采用改良SMSA半選擇培養基分離法和熒光定量PCR法對南平煙區煙草根際青枯病菌進行了動態監測。結果表明，這兩種方法均能有效檢測土壤中的青枯病菌，其中熒光光定量PCR法檢測限更低。2013—2014年連續2年的監測結果表明，煙草移栽后7～10 d即可在煙草根際檢測到青枯病菌，并在整個生長季節不斷積累。

綜合2年調查結果來看，5月底至6月初為南平煙區煙草青枯病的始發期，6月上旬至中旬為病害發展期，6月中下旬為病害爆發流行期。與前人研究結果基本一致[17]，煙草根際土壤青枯病菌數量與病情指數呈正相關，SMSA半選擇培養基分離法則在病原菌數量與病情指數相關性方面略高于熒光定量PCR法。在田間首次發現病株時，利用SMSA半選擇培養基分離法檢測到煙草根際土壤青枯菌含量為5.0×105至5.2×105cfu/mL，而在病害爆發期，煙草根際土壤青枯菌數量則高達2.2×106cfu/mL以上。

氣象條件是影響煙草青枯病發生流行的重要因素，其中溫度被認為是影響青枯病發生和流行的關鍵氣象因子。鄭向華等[18]研究表明，煙草青枯病菌最適宜生長的溫度范圍為28～34℃。徐世典[19]發現青枯病在低于20℃的土壤溫度條件下不能發生。陳順輝等[20]研究發現，當土溫穩定在20℃持續5～10 d，煙草感病品種就開始出現發病癥狀。與上述研究結果一致，本研究發現，周日照時數、周平均氣溫、周相對濕度和周降水量等4個氣象因子中，溫度是影響煙草青枯病菌數量和田間發病程度的關鍵因子。進入5月下旬，周平均氣溫高于22℃時，田間開始出現發病植株。6月上旬至中旬，周平均氣溫穩定在22～25℃，病害處于平穩發展期。6月中下旬，周平均氣溫高于25℃，此時伴隨著降雨，病害進入爆發流行期。

綜上所述，南平煙草青枯病具有發病急、流行快等特點，尤其是在采烤期，病害正處于流行階段，常會造成大面積災害。溫度是煙草青枯病菌繁殖及病害發生的關鍵影響因子，對于指導青枯病的預測預報和防治具有重要的實際意義。生產上建議煙苗要早移栽，盡量使煙草采收期避開發病高峰，最大限度減輕病害損失。此外，監測土壤病原菌數量動態變化也對病害的預測預報及防治具有一定的指導作用。

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The Epidemic Dynamics of Tobacco Bacterial Wilt and Analysis of Related Climate Factors

LIN Yong1,2,XU Qian1,CHEN Zhihou1,KONG Fanyu2,BAI Wanming1*
(1.Nanping Branch of Fujian Tobacco Company,Nanping,Fujian 353000,China;2.Pest Integrated Management Key Laboratory of China Tobacco,Tobacco Research Institute of ChineseAcademy ofAgricultural Sciences,Qingdao 266101,China)

The population of Ralstonia solanacearum and disease index of tobacco bacterial wilt in Nanping were investigated with systematic survey method.The correlations between tobacco bacterial wilt and climate factors were also analyzed.The results showed that semi selective cultures and fluorescent quantitative PCR were both effective in detecting R.solanacearum in soil. However the correlation between the pathogen population and disease index by the method of semi selective cultures(R2=0.8191) was higher than that by fluorescent quantitative PCR(R2=0.7464).The temperature was the key factor among precipitation, temperature sunlight and humidity which contribute to pathogen population and disease index.In late May to early June when the 7 d average of temperature was higher than 22℃,tobacco bacterial wilt entered initial stage with the amount of pathogen population higher than 5.0×105cfu/mL.Then disease entered a stable period of development from the first ten days to the second ten days of June,At this stage,the average temperature of 7 d ranged from 22 to 25℃,the pathogen population varied between 1.0×105and 2.2×106cfu/g.The epidemic outbreak of tobacco bacterial wilt was in the middle and the last ten-day period of June when the average of temperature was higher than 25℃.At this stage,the pathogen population was higher than 2.2×106cfu/g.Therefore,the temperature is important in forecasting and prevention of tobacco bacterial wilt in Nanping.

tobacco;bacterial wilt;climate factor;correlation;Nanping

S435.72

1007-5119（2016）03-0057-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.010

中國煙草總公司重點項目（110200902065）；福建省煙草公司南平市公司科技計劃項目（NY201203）

林勇（1984-），男，碩士，助理農藝師，主要從事煙葉生產技術研究。E-mail：linyongnp@126.com。*通信作者，E-mail：baiwmnp@163.com

2016-01-27

2016-05-06