黃連上清丸、護肝片及牛黃解毒丸對藥物代謝酶CYP3A4活性的影響

周國堅　葉董婷　鄧旭杏

1.珠海市第二人民醫(yī)院，廣東　珠海　519020；2.佛山市仁匯醫(yī)藥科技有限公司，廣東　佛山　528000

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黃連上清丸、護肝片及牛黃解毒丸對藥物代謝酶CYP3A4活性的影響

周國堅1葉董婷2鄧旭杏2

1.珠海市第二人民醫(yī)院，廣東珠海519020；2.佛山市仁匯醫(yī)藥科技有限公司，廣東佛山528000

【摘要】目的：觀察黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸對CYP3A4活性的影響。方法：利用體外肝微粒體培育體系，以咪達唑侖作為探針底物，研究黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸對人肝微粒體細胞色素 P4503A4(CYP3A4)活性的影響。結果：與空白組對比，黃連上清丸、牛黃解毒丸對CYP3A4活性表現(xiàn)為誘導作用，護肝片對CYP3A4活性表現(xiàn)為抑制作用。結論：在與臨床上經(jīng) CYP3A4代謝的藥物聯(lián)合應用時，應警惕黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸潛在藥物之間的相互作用。

【關鍵詞】黃連上清丸；護肝片；牛黃解毒丸；細胞色素 P4503A4

細胞色素P450酶是人體內(nèi)的肝藥酶，廣泛分布于肝臟等器官。研究發(fā)現(xiàn)，有20多種同工酶與藥物代謝相關性高，共同參與人體內(nèi)300余種藥物的代謝[1]。多種藥物同時使用時，若其中藥物是CYP3A4的誘導劑或抑制劑，則會顯著影響合用中其他藥物的代謝，也會對其他藥物的療效產(chǎn)生影響。研究表明，多種中藥提取物對P450活性有一定影響，如銀杏、五味子、白芷、羌活等甲醇提取物對CYP3A4有抑制作用[2-3]。利用體外實驗預測藥物在體內(nèi)是否發(fā)生藥物代謝性相互作用，是藥物代謝研究的熱點內(nèi)容。研究黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸對重組人肝微粒體細胞色素酶rCYP3A4的影響，結果如下。

1儀器與材料

1.1儀器MINI-10K微型離心機(常州朗越儀器制造有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；XH-C旋渦混合器(常州朗越儀器制造有限公司)；DW-86L386立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；FE20實驗室pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；LC3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)。

1.2材料人重組肝細胞微粒體CYP3A4(批號：M41013，SPIBIO產(chǎn))；咪達唑侖注射液(批號：20140607，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；1-羥基咪達唑侖(批號：FN08081402，Cerilliant)；卡馬西平(批號：100142-201105，中國食品藥品檢定研究院)；酮康唑(批號：SM0325YF13，上海源葉生物科技有限公司)；NADPH(批號：WO1028EA14，上海源葉生物科技有限公司)。黃連上清丸(批號:14060026，太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司)；牛黃解毒丸(批號：13012307，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)；護肝片(批號：201405102，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)。乙腈(批號：20141021，天津市大茂化學試劑廠)；甲醇(批號：20140723，廣東光華科技股份有限公司)；磷酸氫二鉀(批號：20140701-2，廣州化學試劑廠)；三羥甲基氨基甲烷(批號：TA0429CA14，上海源葉生物科技有限公司)；無水氯化鎂(批號：20140412，天津市福晨化學試劑廠)；碳酸氫鈉(批號：20140701-1，廣州化學試劑廠)。

2實驗方法

2.1溶液的配制

2.1.1咪達唑侖的配制精密吸取咪達唑侖注射液360μl(相當于咪達唑侖1.8mg)，置于5ml容量瓶中，用純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度均為1.0mmol/l的儲備液，置于4℃冰箱備用。精密吸取1ml于10ml容量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻，得到濃度為100μmol/l的咪達唑侖溶液。

2.1.21-羥基咪達唑侖標準溶液的配制精密吸取100μl 1-羥基咪達唑侖于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1μg/ml的儲備液，精密吸取1ml 100μl 1-羥基咪達唑侖儲備液于10ml容量瓶中，甲醇定容制刻度，得到100ng/ml的儲備液，置于冰箱4℃下保存待用。 2.1.3卡馬西平內(nèi)標溶液的配制精密稱取10.0mg卡馬西平于10ml容量瓶中，用乙腈定容得到1mg/ml的卡馬西平儲備液，從儲備液中精密吸取20.0μl到10ml容量瓶中，用乙腈定容得到濃度為2.00μg/ml的內(nèi)標溶液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的配制 取磷酸二氫鉀1.36g，加 0.1mol/l氫氧化鈉溶液79ml，用水稀釋至200ml，即得PBS溶液。2.1.5陽性抑制劑酮康唑的配制精密稱取酮康唑26.5mg于5ml容量瓶中，用PBS溶液(pH 7.4)溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為10.0mmol/l的儲備液，置于4℃冰箱備用。

2.1.6氯化鎂溶液的配制精密稱量47.5mg氯化鎂于10ml容量瓶中，用PBS溶液(pH 7.4)充分溶解，定容搖勻，得到50.00mmol/l的氯化鎂溶液。

2.1.7NADPH溶液的配制精密稱量8.3mg的NADPH用PBS溶液(pH 7.4)稀釋得到濃度為10.0mmol/l的NADPH，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃冰箱避光保存。

2.1.8人重組肝細胞微粒體CYP3A4的配制精密吸取100μl人重組肝細胞微粒體 CYP3A4，置于1ml容量瓶，用PBS溶液(pH 7.4)配制成濃度為100pmol/l的溶液，置于-20℃冰箱中保存。

2.2孵育體系與樣品處理[4-5]

2.2.1孵育體系肝微粒體體外孵育體系的總體積為200μl：20μlCYP3A4(終濃度為10pmol·l-1)，20μl氯化鎂(終濃度為5.00mmol·l-1)，10μl咪達唑侖(終濃度為5μmol·l-1)，剩余體積用PBS緩沖溶液(pH7.4)補充，37℃水浴中孵育5min后，加入20μl NADPH(終濃度為1.0mmol/l)啟動反應，反應5min。2.2.2樣品處理孵育結束后，馬上向孵育體系中加入100μl冰乙腈(含內(nèi)標物質(zhì)-卡馬西平2μg/ml)終止反應，渦旋混合1min，-20℃下放置10min，10000r/min高速離心10min，取上清液過濾，吸取20μl注入到HPLC儀中測定。

2.3色譜條件[6]色譜柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.00ml/min；柱溫：40℃；檢測波長：230nm；流動相：10.0mmol/L醋酸銨緩沖液-甲醇(42∶58)；進樣量：20μl。

2.4分組與給藥[7]體外孵化反應分為陽性對照組、陰性對照組和試藥組。陰性對照組中加入磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，陽性對照組中加入酮康唑溶液(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.5、1、10、50μmol/l)；試藥組給予以磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋的不同濃度的中成藥溶液。孵育體系總體積均為200μl，根據(jù)“2.2孵育體系與樣品處理”項下進行反應并處理。將所有樣品按“2.3色譜條件”項下進行測定，根據(jù)代謝產(chǎn)物1-羥基咪達唑侖的生成率可確定 CYP3A4酶的相對活性(即試藥組占陰性對照組生成率的百分比)，計算半數(shù)抑制率(IC50)。

表1　反應體系　(200μl)

2.5標準曲線的制備取6只EP管，加入1-羥基咪達唑侖儲備液，使1-羥基咪達唑侖的終濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000ng/ml，按照體外孵育和樣品處理方法“2.2孵育體系與樣品處理”項操作，取上清液20μl進樣，以1-羥基咪達唑侖和卡馬西平的峰面積比值(Y)和含量(X)進行加權回歸。

2.6酮康唑IC50的測定及抑制活性的評價在肝微粒體孵育體系中陽性抑制劑酮康唑對CYP3A4介導的咪達唑侖1-羥基化反應有強抑制作用。陽性對照組中加入酮康唑溶液，使其終濃度為：0.025、0.1、0.5、1、10、50μmol/l，根據(jù)“2.2孵育體系與樣品處理”項下進行反應并處理，根據(jù)1-羥基咪達唑侖的生成率來確定 CYP3A4酶的相對活性(即實驗組占陰性對照組生成率的百分比)，計算半數(shù)抑制率IC50。

2.7對rCYP3A4活性影響的初步篩選

2.7.1樣品配制[7]根據(jù)說明書，分別取治療量的黃連上清丸、護肝片、牛黃解毒丸，經(jīng)處理后，分別置于100ml容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，超聲30min，濾過，濾液作為儲備液。將中成藥分為低、中、高劑量組，低、高劑量組則分別為中劑量組的1/2 和2 倍。并同時設置空白組。每個樣品平行做3份。

2.7.2酶孵化的條件反應體系中先分別加入PBS(pH7.4)、咪達唑侖、氯化鎂、rCYP3A4和待測藥物的儲備液，置于37℃水浴中預孵化振蕩5 min后，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動孵化反應。37℃水浴振蕩反應5min后，加入冰乙腈(含內(nèi)標物質(zhì)-卡馬西平2μg/ml)終止反應。渦旋混合1 min，-20℃下放置10min ，10000rpm離心5 min，取上清液過濾，吸取濾液20μl注入HPLC儀中，按“2.3色譜條件”項下色譜條件進樣測定，測定咪達唑侖代謝產(chǎn)物1-羥基咪達唑侖的濃度。

2.7.3代謝產(chǎn)物的測定使用HPLC儀按“2.3色譜條件”項下色譜條件進樣分析，測定1-羥基咪達唑侖與卡馬西平的含量，考察對CYP3A4活性影響較大的中成藥。代謝產(chǎn)物1-羥基咪達唑侖的生成率越低，表示抑制作用越強。

表2　對rCYP3A4活性影響的初步篩選

2.8對rCYP3A4活性抑制作用的強弱(IC50值)的計算

2.8.1酶孵化的條件參見“2.7對rCYP3A4活性影響的初步篩選”項下“2.7.2酶孵化的條件”項操作。

2.8.2代謝產(chǎn)物的測定參見“2.7對rCYP3A4活性影響的初步篩選”項下“2.7.3酶孵化的條件”項操作。

2.8.3IC50的測定 通過體外初步篩選后，在固定CYP3A4濃度、探針底物咪達唑侖濃度和NADPH濃度的同時，改變待測中成藥的濃度，測定不同濃度下中成藥對1-羥基咪達唑侖生成率的影響，判斷對CYP3A4的抑制程度，估計中成藥對rCYP3A4活性的影響強弱。以中成藥濃度對數(shù)值為橫坐標(X)，CYP3A4酶的相對活性(%)表示為縱坐標(Y)，計算IC50值和95%的可信范圍[8]，計算公式為：Y=min×(max-min)/ [1+10^(X-LogIC50)]。

3結果

3.1專屬性考察按“2.3色譜條件”項下色譜條件進樣測定，1-羥基咪達唑侖，卡馬西平的分離度好(>1.5)，1-羥基咪達唑侖與卡馬西平出峰時間分別在15.4min，8.6min。見圖1-3。

3.2標準曲線以1-羥基咪達唑侖和卡馬西平的峰面積比(Y)和含量(X)進行加權回歸，得到Y=0.0013X+0.0024 (R2=0.9937，n=6)，表明1-羥基咪達唑侖在10-1000ng范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，結果見圖4。

3.3陽性對照組酮康唑對rCYP3A4酶相對活性計算 IC50為0.06538μmol/l，95%區(qū)間為0.04542～0.0941，符合文獻[8]范圍(0.06～0.16μmol/l)，表明所用的孵育體系可以滿足CYP3A4酶抑制活性的評價及測定其他抑制劑IC50的要求。

3.4對rCYP3A4活性影響的初步篩選由表3可看出：黃連上清丸、牛黃解毒丸對CYP3A4酶表現(xiàn)出誘導作用，護肝片對CYP3A4酶表現(xiàn)出抑制作用。

表3　對rCYP3A4活性影響的初步篩選　

組別1-羥基咪達唑侖含量/ng/ml空白組小劑量組中劑量組大劑量組牛黃上清丸101.5±21.67162.3±12.57315.1±26.38523.9±41.69牛黃解毒丸69.96±15.7691.28±25.96233.9±41.68576.6±51.31護肝片69.38±3.85153.01±2.88113.98±3.3655.610±4.520

3.5對rCYP3A4活性抑制作用護肝片的IC50值與95%區(qū)間見表4。

表4　對rCYP3A4活性抑制大小

4討論

CYP3A4肝臟和腸道重要代謝酶，含量可達到肝臟CYP450總量的60%，腸道CYP450總量的70%[9]，是藥物代謝的主角。中成藥說明書中【藥物相互作用】欄均未見報道，只是簡單書寫“如與其他藥物同時使用可能會發(fā)生藥物相互作用，詳情請咨詢醫(yī)師或藥師”。基于此，本研究對完善中成藥的說明書有一定幫助作用，對臨床合理用藥提供參考性依據(jù)。實驗結果顯示，黃連上清丸、牛黃上清丸對CYP3A4有誘導作用，護肝片對CYP3A4有抑制作用，護肝片的IC50為4.055g，因此在使用時，要考慮其潛在的藥物相互作用。

參考文獻

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基金項目：珠海市衛(wèi)生和計劃生育局醫(yī)學科研立項資助項目(編號：2013061)。

作者簡介：周國堅(1980-)，男，本科，副主任藥師，主要從事臨床藥學研究。

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)10-0018-03

(收稿日期：2016.03.28)