H PLC測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊原料藥中光學(xué)異構(gòu)體

曹天海（昆明積大制藥股份有限公司國際GMP認(rèn)證部，云南 昆明 650106）

H PLC測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊原料藥中光學(xué)異構(gòu)體

曹天海
（昆明積大制藥股份有限公司國際GMP認(rèn)證部，云南 昆明 650106）

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊中光學(xué)異構(gòu)體含量的方法。方法：對(duì)于非對(duì)映異構(gòu)體，采用C18色譜柱，以乙腈-25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（含0.1%三乙胺，用磷酸調(diào)pH值至4.0）（25∶75）為流動(dòng)相；對(duì)于對(duì)映異構(gòu)體，采用Chiralcel，OD-RH色譜柱，以100 mmol六氟磷酸鉀水溶液-乙腈（70∶30）為流動(dòng)相；非對(duì)映異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體檢測(cè)波長分別為217 nm和240 nm。結(jié)果：鹽酸帕洛諾司瓊4個(gè)異構(gòu)體線性關(guān)系良好，定量限和檢測(cè)限、方法回收率滿足要求。結(jié)論：本法靈敏、可靠，可用于鹽酸帕洛諾司瓊中光學(xué)異構(gòu)體的質(zhì)量控制。

鹽酸帕洛諾司瓊；高效液相色譜；光學(xué)異構(gòu)體；測(cè)定

鹽酸帕洛諾司瓊（palonosetron hydrochloride），化學(xué)名（3aS）-2-［（3S）-1-氮雜雙環(huán)［2.2.2]辛烷-3-基]-2，3，3a，4，5，6-六氫-1-氧代-1H-苯并［de]異喹啉鹽酸鹽（圖1）。鹽酸帕洛諾司瓊注射液是5-HT3受體拮抗劑，用于預(yù)防在實(shí)施中度或高度致嘔吐性化療方案時(shí)所引起的急性和遲發(fā)性嘔吐，2003年由美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)在美國上市。鹽酸帕洛諾司瓊分子中含有2個(gè)手性中心，應(yīng)存在一個(gè)對(duì)映體（RR-異構(gòu)體）和一對(duì)非對(duì)映體（SR-異構(gòu)體和RS-異構(gòu)體）。本文建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊中光學(xué)異構(gòu)體的方法，采用普通反相色譜法測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，采用手性固定性拆分了對(duì)映異構(gòu)體，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠。

圖1　　鹽酸帕洛諾司瓊結(jié)構(gòu)式

1儀器與試藥

島津 LC-2010CHT高效液相色譜儀，包括CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；戴安Summit P680高效液相色譜儀，包括Chameleon色譜工作站。

鹽酸帕洛諾司瓊（批號(hào)：130901，130902，131001）、鹽酸帕洛諾司瓊SS、RR、SR、RS對(duì)照品（均由昆明積大制藥股份有限公司提供）；乙腈為色譜純、水為重蒸餾水、其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1溶液配制

取本品適量，精密稱定，加水制成每1 mL中含0.06 mg的溶液，作為供試品溶液。

取供試品溶液1 mL，加水溶解并稀釋制成100 mL，作為對(duì)照溶液。

2.2色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）（Akzo Nobel公司），用于測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，Chiralcel，OD-RH（4.6 mm ×150 mm，5 μm）（大賽璐公司），用于測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體；流動(dòng)相：乙腈-25 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（含0.1%三乙胺，用磷酸調(diào)pH值至4.0）（25∶75），用于測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，100 mmol六氟磷酸鉀水溶液-乙腈（70∶30）用于測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體；流速：1.0 mL/min用于測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，0.6 mL/min用于測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：217 nm用于測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，240 nm用于測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體；進(jìn)樣量：50 μL用于測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，50 μL用于測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體。理論塔板數(shù)按鹽酸帕洛諾司瓊計(jì)算應(yīng)不低于1 500。測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，本品與鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體的分離度不得低于1.0；測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，本品及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體的分離度不得低于1.5。

圖2　非對(duì)映異構(gòu)體HPLC圖

圖3對(duì)映異構(gòu)體HPLC圖

2.3波長選擇

取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品、鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體、鹽酸帕洛諾司瓊 RS-異構(gòu)體及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體對(duì)照品分別加水制備成每1 mL中約含20 μg的溶液，測(cè)定各對(duì)照品的紫外吸收光譜，結(jié)果表明各對(duì)照品在240 nm附近處均有較強(qiáng)吸收，考慮到本品非對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定色譜條件與有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的色譜條件一致，因此選用有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定波長217 nm測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體，選定240 nm作為對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)波長。

2.4專屬性

2.4.1非對(duì)映異構(gòu)體取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品、鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體、鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體對(duì)照品各適量，加水分別制成0.06 mg/mL的溶液；分別取上述溶液各50 μL，記錄色譜圖，鹽酸帕洛諾司瓊保留時(shí)間為9.942 min，鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體保留時(shí)間為9.453 min，鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體保留時(shí)間為9.391 min。取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品和鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體對(duì)照品各適量，加水制成每 1 mL含鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品0.06 mg和鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體對(duì)照品0.000 3 mg的溶液，作為非對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，取上述溶液50 μL，記錄色譜圖，本品及鹽酸帕洛諾司瓊分離度為1.26，達(dá)到基線分離，符合要求。取鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體及SR-異構(gòu)體溶液各0.5 mL，混勻，取上述溶液各50 μL，記錄色譜圖，得到一個(gè)色譜峰，說明鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體及SR-異構(gòu)體出峰位置相同，可以合并計(jì)算。

2.4.2對(duì)映異構(gòu)體取鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品、鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體各適量，加水分別制成0.06 mg/mL的溶液；分別取上述溶液各50 μL，記錄色譜圖，鹽酸帕洛諾司瓊保留時(shí)間為23.479 min，鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體保留時(shí)間為25.521 min。取鹽酸帕洛諾司瓊及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體溶液各0.5 mL，混勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，取上述溶液50 μL，記錄色譜圖，本品及鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體分離度為 1.68，達(dá)到基線分離，符合要求。

2.5精密度

2.5.1非對(duì)映異構(gòu)體取“2.4.1”中系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品與非對(duì)映異構(gòu)體（SR）主峰的RSD值，分別為2.9% 和2.0%，均小于3.0%。

2.5.2對(duì)映異構(gòu)體取“2.4.2”中系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品與對(duì)映異構(gòu)體（RR）主峰的RSD值，分別為0.3%和0.4%，均小于2.0%。

2.6檢測(cè)限與定量限

按信噪比為3∶1得出檢測(cè)限，信噪比為10∶1得出定量限。

2.6.1非對(duì)映異構(gòu)體鹽酸帕洛諾司瓊和SR-異構(gòu)體檢測(cè)限分別為0.005 6 μg/mL和0.006 1 μg/mL；定量限分別為0.016 8 μg/mL和0.018 3 μg/mL；鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體檢測(cè)限為0.005 5 μg/mL，定量限為0.016 5 μg/mL。

2.6.2對(duì)映異構(gòu)體鹽酸帕洛諾司瓊和鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體定量限分別為0.036 μg/mL和0.036 μg/mL，檢測(cè)限為0.012 μg/mL及0.012 μg/mL。

2.7線性和范圍及相對(duì)響應(yīng)因子

2.7.1非對(duì)映異構(gòu)體分別取“2.4”專屬性中鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品及鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體溶液各 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于100 mL量瓶中，以水稀釋至刻度。分別取50 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)。得出鹽酸帕洛諾司瓊線性范圍為 0.000 122～0.000 732 mg/mL，回歸方程為：

y=1 464.87x+0.006 1，

相關(guān)系數(shù)為0.999 0；鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體線性范圍為0.000 112～ 0.000 672 mg/mL，回歸方程為：

y=1 302.09x-0.017，

相關(guān)系數(shù)為0.999 9。同法得出鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體線性范圍為0.000 22～0.000 66 mg/mL，回歸方程為：

y=1 489.73x-0.004，

相關(guān)系數(shù)為0.998 7。分別以鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體和鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體回歸方程的斜率除以鹽酸帕洛諾司瓊回歸方程的斜率，得到鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體和鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊相對(duì)響應(yīng)因子分別為0.9和1.0，均為0.9～ 1.1，說明可以用鹽酸帕洛諾司瓊自身對(duì)照溶液代替鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體和鹽酸帕洛諾司瓊RS-異構(gòu)體作為對(duì)照溶液。

2.7.2對(duì)映異構(gòu)體分別精密移取“2.4.2”中鹽酸帕洛諾司瓊對(duì)照品溶液、鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體對(duì)照品溶液各0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。分別取50 μL進(jìn)樣，得出鹽酸帕洛諾司瓊線性范圍為0.000 125～ 0.000 752 mg/mL，回歸方程為：

A=108 906 199C-1 979.17，

相關(guān)系數(shù)為0.999 6；鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體線性范圍為0.000 124～ 0.000 743 mg/mL，回歸方程為：

A=109 708 146C-2 394.363，

相關(guān)系數(shù)為0.999 8。分別以鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體回歸方程的斜率除以鹽酸帕洛諾司瓊回歸方程的斜率，得到鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體對(duì)鹽酸帕洛諾司瓊相對(duì)響應(yīng)因子為 1.0，處于0.9～ 1.1之間，說明可以用鹽酸帕洛諾司瓊自身對(duì)照溶液代替鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體為對(duì)照溶液。

2.8準(zhǔn)確度

2.8.1非對(duì)映異構(gòu)體取本品已測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體的原料藥 1批（130901），加水制成每1 mL中含有0.6 mg鹽酸帕洛諾司瓊的溶液，分別精密移取 10 mL，置 100 mL量瓶中，共制備 9份，分別加入濃度為0.055 mg/mL的鹽酸帕洛諾司瓊SR-異構(gòu)體溶液各0.40，0.50，0.60 mL各3份，依法測(cè)定，平均回收率為96.3%，RSD為3.0%。

2.8.2對(duì)映異構(gòu)體取本品已測(cè)定對(duì)映異構(gòu)體的原料藥 1批（130901），加水制成每1 mL中含有0.6 mg鹽酸帕洛諾司瓊的溶液，分別精密移取10 mL，置100 mL量瓶中，共制備9份，分別加入濃度為0.048 5 mg/mL的鹽酸帕洛諾司瓊RR-異構(gòu)體溶液0.40，0.50，0.60 mL各3份；依法測(cè)定，平均回收率為95.7%，RSD為3.2%。

2.9樣品測(cè)定

本品 3批樣品（130901，130902，131001）非對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定結(jié)果分別為0.05%，0.05%，0.04%；對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定結(jié)果均未檢出。

3討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1]，鹽酸帕洛諾司瓊的合成路線有4條，無論采用哪條路線，均需測(cè)定本品光學(xué)異構(gòu)體的含量。

文獻(xiàn)［2]已經(jīng)報(bào)道了本文中非對(duì)映異構(gòu)體測(cè)定方法的色譜條件，但是僅用于本品中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，沒有發(fā)現(xiàn)此色譜條件也可用于非對(duì)映異構(gòu)體的測(cè)定。

目前，文獻(xiàn)［3-6]報(bào)道的測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊光學(xué)異構(gòu)體的方法主要為正相色譜法，方法的檢測(cè)靈敏度與本法相比較差。

本方法快速、簡便，所用的色譜條件均為反相色譜條件，也可直接用于本品注射液中光學(xué)異構(gòu)體的測(cè)定，無需因注射液輔料中含有大量無機(jī)鹽而進(jìn)行前處理。

［1]楊新華，歐陽強(qiáng).鹽酸帕洛諾司瓊合成路線圖解［J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（3）：231-233.

［2]沈曦，周慧，王萬青，等.反相高效液相色譜法檢測(cè)鹽酸帕洛諾司瓊及其有關(guān)物質(zhì)［J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24（4）：307-308.

［3]于曉蓉，宋敏，杭太俊.鹽酸帕洛諾司瓊光學(xué)異構(gòu)體的手性HPLC檢查［J].中國新藥雜志，2008，17（10）：870-872.

［4]李霞，高媛，胥娜，等.手性拆分法同時(shí)測(cè)定鹽酸帕洛諾司瓊光學(xué)異構(gòu)體［J].中南藥學(xué)，2015，13（4）：406-409.

［5]趙慧英，李桂萍，吳敬飛，等.鹽酸帕洛諾司瓊3個(gè)光學(xué)異構(gòu)體的分離與測(cè)定［J].藥物分析雜志，2012，32（6）：978-980.

［6]潘紅娟，楊哲峰，時(shí)惠麟，等.鹽酸帕洛諾司瓊注射液中異構(gòu)體含量的 NP-HPLC測(cè)定［J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（8）：610-612.

Determination of Isomers and Enantiomer in Palonosetron Hydrochloride by HPLC

Cao Tianhai（International GMP Certification Department，Kunming Jida Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yunnan Kunming 650106，China）

Objective：To develop a HPLC method for determination of isomers and enantiomer in palonosetron hydrochloride.Methods：Isomers were determined by a C18column with the mobile phase of 25 mmol/L sodium dihydrogen phosphate buffer（containing 0.1%triethylamine，of which pH value was adjusted to 4.0 by phosphoric acid）-acetonitrile（75∶25）.However，enantiomers were determined by a Chiralcel，OD-RH column with the mobile phase of 100 mmol potassium hexafluorophosphate solution-acetonitrile（70∶30）.The wavelengths for detection of isomers and enantiomers were 217 and 240 nm respectively.Results：The calibration curve of isomers and enantiomers of palonosetron hydrochloride showed good linearity，while the LOQ，LOD and accuracy met the relevant requirements.Conclusion：The developed methods was sensitive and reliable，which might be used for the quality control of isomers and enantiomer in palonosetron hydrochloride.

Palonosetron Hydrochloride；HPLC；Optical Isomer；Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.05.007

曹天海，男，碩士，工程師。主要從事藥物研發(fā)工作。E-mail：skyrin_jida@126.com

2016-02-14）