虉草ISSR-PCR反應體系優化與引物篩選

張永亮，劉　鵬，駱秀梅，劉　楊

(內蒙古民族大學，內蒙古 通遼　028042)

?

虉草ISSR-PCR反應體系優化與引物篩選

張永亮，劉鵬，駱秀梅，劉楊

(內蒙古民族大學，內蒙古 通遼028042)

22個虉草基因組DNA為ISSR-PCR 擴增模板，采用單因素試驗方法，對影響PCR 擴增體系中dNTP、引物濃度、Taq酶和模板DNA 用量4個因素及引物退火溫度進行梯度試驗，優化得到最佳的ISSR-PCR 反應體系，即20μL 反應體系中分別加入0.3 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL 10×PCR Buffer(mg2+plus)，1.5 μL dNTP (2.5 mmol/L)，1.5 μL引物(10 pmol/μL)，50 ng模板DNA，ddH2O 補足體積。以此體系對24條引物進行篩選，最終獲得了多態性高，重復性好的引物12條。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的適宜退火溫度為55℃，引物835，841和842 的適宜退火溫度為56℃，而引物810和834 的適且退火溫度分別為52℃和54℃。12條引物共擴增總條帶數192條，其中，多態性條帶數173條，多態位點百分率89.81%。

虉草；ISSR-PCR反應體系；引物篩選

虉草(Phalarisarundinacea)，屬于禾本科(Gramineae)、虉草屬植物，別名草蘆、園草蘆。主要分布于歐洲、北美和亞洲，在我國主要分布于東北、華北、華中、華東等地區。虉草耐鹽堿、耐濕澇，又耐旱，生長快，營養繁殖能力強，產草量高、葉量豐富，蛋白質含量高，被廣泛用于飼草、人工濕地植物、生物能源材料或造紙原料等[1-2]。國內有關虉草的耐鹽性和生產性能已有較多報道[3-7]，而有關虉草分子標記研究甚少[8]。因此，試驗旨在通過研究ISSR-PCR反應中各項參數變化對試驗結果的影響，并對反應體系進行優化，建立適用于虉草的ISSR反應體系，并進行ISSR引物篩選，為進一步研究虉草種群遺傳多樣性奠定基礎。

ISSR是一種建立在PCR反應基礎上的DNA分子標記技術， 由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz 等[9]于1994年創建。ISSR技術可重復性強，多態性更好，而且不需知道被檢測物種任何基因組的信息，因此，ISSR標記被廣泛應用于植物遺傳多樣性研究[10-12]。ISSR-PCR反應結果主要受到TaqDNA 聚合酶、引物、模板、Mg2+、dNTP等5種因素的影響[13-17]。試驗以22個虉草基因組DNA 為模板，采用單因素試驗設計方法，通過研究ISSR-PCR 反應中各項參數變化對試驗結果的影響，優化ISSR-PCR 反應體系，篩選出適合虉草ISSR 研究的引物，旨在建立適合虉草的ISSR 反應體系，為虉草遺傳多樣性、種質資源篩選和分子標記輔助育種等方面的研究奠定基礎。

1　材料和方法

1.1供試材料

供試22份虉草材料及其來源見表1。在實驗室內用花盆培養，待幼苗生長至4～5片葉時摘取植株頂部以下第2片嫩葉用于基因組DNA的提取。

1.2虉草基因組DNA的提取及檢測

試驗采用新型快速植物基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，離心柱型)，提取虉草基因組DNA，方法按照說明書進行。

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，取5 μL模板DNA，混合1 μL 6×Loading Buffer，設標準分子量為DL2000 Marker，緩沖電壓設為100 V穩定電壓(5 v/cm2)，1×TAE緩沖液電泳90 min分離，EB(溴化乙錠)染色。電泳結果采用凝膠成像系統檢測并記錄。根據電泳檢測結果，將符合要求的DNA 溶液分裝于1.5 mL的離心管中，在-20℃保存備用。

表1　22分不同產地的虉草

注：供試材料1～16號來源于國家草種質資源中期庫

1.3虉草ISSR-PCR反應體系的建立及優化

根據有關禾本科牧草ISSR分子標記相關文獻[18-22]，從100條ISSR引物中挑選出24條引物(表2)。引物序列由上海生物工程技術服務有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶購于TaKaRa公司。

針對模板DNA濃度、dNTP濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度(10×PCR Buffer，含2 μL mg2+)等影響因素，利用單因素水平梯度試驗對ISSR-PCR反應體系中的各個因素的適宜濃度進行單因素梯度試驗逐一優化。在確定最佳反應條件時，參照文獻[13-17]中的ISSR擴增程序和反應體系進行，對反應體系各因素設置不同梯度水平(表3)，2 μL 10×PCR Buffer(mg2+plus)，以DL2000作為對照。當試驗中對某一因素進行梯度設置時，其余因素均保持不變。在最佳反應體系確定的基礎上，再進一步篩選每一個引物的最佳退火溫度。

表2　ISSR標記的引物

注：* Y =(C，T)

表3　ISSR-PCR反應的因素和水平

1.4引物的篩選

根據確定的ISSR-PCR反應體系及反應程序，選取2個虉草DNA模板對24條ISSR引物進行初步篩選。選取擴增穩定、條帶多、信號強、背景清晰的引物用于后續的ISSR-PCR反應。

1.5PCR擴增及擴增產物的檢測和分析

PCR擴增反應完成后，用預先制好的濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。緩沖電壓設為90U，1×TAE緩沖液電泳分離，待溴酚藍遷移至凝膠的2/3處，停止電泳，取出凝膠置于紫外凝膠自動成像儀拍照并保存。根據ISSR-PCR分子標記的原理及方法對擴增產物進行比較分析，確定最佳虉草ISSR-PCR反應體系及擴增程序。

2　結果與分析

2.1DNA檢測

通過瓊脂糖電泳檢測DNA質量，圖1中DNA電泳帶沒有拖尾現象且圖像較為清楚，可知所提DNA純度較高，RNA和蛋白質含量較少，符合ISSR-PCR分析要求。

2.2PCR 反應體系對虉草ISSR-PCR擴增的影響

2.2.1dNTP濃度對虉草ISSR-PCR擴增的影響dNTP是ISSR-PCR反應的原料底物，對擴增條帶有很大的影響。濃度過高會出現非特異性擴增，濃度太低則擴增產物不完全，導致產率下降。試驗表明，dNTP添加量為0.5 μL和1.0 μL時擴增條帶較弱； 添加量為1.5 μL時擴增出的條帶最清晰，并且多態性好(圖2)。但當添加量為2.0 μL時，擴增條帶的亮度較1.5 μL時的擴增條帶暗，綜合考慮，選擇1.5 μL作為 ISSR-PCR 反應體系中 dNTP 的最佳添加量。

2.2.2模板DNA濃度對虉草ISSR-PCR擴增的影響試驗結果表明DNA 濃度在30和40 ng時，擴增條帶弱，50和60 ng時條帶比較完整，其中50 ng時條帶最為清晰(圖3)。綜合考慮，選擇50 ng作為 ISSR-PCR 反應體系中模板DNA的最佳濃度。

圖1　22份虉草基因組DNA電泳圖Fig.1　The electrophoresis on Genomic DNA of 22 Phalaris arundinacea materials注：從左到右依次為DL2000Marker、品種代號1～22號

圖2　不同dNTP濃度下ISSR-PCR擴增Fig.2　Effect of dNTPs concentration on ISSR-PCR amplification注：從左到右依次為DL2000 Marker、0.5、1.0、1.5、2.0 μL

2.2.3引物濃度對虉草ISSR-PCR擴增的影響在不同引物濃度下所擴增出的條帶，當添加量為0.5 μL 時，擴增產物不完全，且條帶清晰度不高。當添加量為1.0和1.5 μL時，反應穩定，條帶清晰，從擴增效果圖中可以看出添加量為1.5 μ條帶更容易辨別(圖4)。當添加量為2.0 μL時，產生非特異性擴增。綜合分析，選擇1.5 μL作為 ISSR-PCR 反應體系中引物的最佳添加量。

2.2.4Taq酶濃度對虉草ISSR-PCR擴增的影響當Taq酶用量為0.1 μL和0.2 μL時合成效率低；用量為0.3 μL和 0.4 μL時，擴增條帶多態性好并且條帶清晰易分辨(圖5)。結合整個試驗成本等因素綜合考慮，選用0.3 μL 的Taq酶用量作為ISSR-PCR 反應體系中引物的最佳濃度。

圖3　不同DNA濃度下ISSR-PCR擴增Fig.3　Effect of template DNA concentration on ISSR-PCR amplification注：從左至右依次為DL2000 Marker、30、40、50、60 ng

圖4　不同引物濃度下ISSR-PCR擴增Fig.4　Effect of primer concentration on ISSR-PCR amplification注：從左至右依次為DL2000 Marker、0.5、1.0、1.5、2.0 μL

圖5　不同Taq酶下的ISSR-PCR擴增Fig.5　Effect of Taq DNA polymerase concentration on ISSR-PCR amplification注：從左至右依次為DL2000 Marker、0.1、0.2、0.3、0.4 μL

2.3虉草ISSR-PCR最佳反應體系的確定

通過諸多因素的優化試驗分析，篩選出了虉草的ISSR-PCR最佳反應體系和最適擴增程序。反應體系為20 μL，其中，TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×PCR Buffer 2 μL、dNTP 1.5 μL、模板DNA50 ng、引物1.5 μL、ddH2O 13.7 μL。

2.4最適退火溫度和ISSR-PCR擴增程序的確定

根據上海生物工程技術服務有限公司推薦的引物退火溫度范圍，對22份不同產地虉草ISSR-PCR 退火溫度、時間與循環次數進行單因素試驗表明，引物UBC808、809、811、815、818、820、826適宜退火溫度為

55℃，引物835，841和842適宜退火溫度為56℃，而引物810和834退火溫度分別為52℃和54℃時才能得到穩定、清晰的特異性譜帶。ISSR-PCR擴增的程序第1階段，94℃預變性5 min；第2階段，94℃變性45 s、退火60 s(退火溫度參照所用引物的最適溫度)、72℃延伸120 s，共進行35個循環；第三階段，72℃延伸10 min。

2.5最佳反應體系的驗證

運用單因素試驗所獲得的最佳反應體系和最適退火溫度，通過多次驗證得出的最適擴增程序，隨機選用引物UBC810、818、826和842對22份不同產地的虉草材料進行 ISSR-PCR 擴增(圖6～9 )。結果表明，4個供試引物的擴增條帶都比較清晰，多態性較豐富，穩定性和重復性好。表明運用單因素試驗所獲得的最佳反應體系和最適退火溫度可以作為虉草基因組DNA的ISSR-PCR反應的最佳優化體系。

2.6引物篩選

根據PCR產物電泳圖，以擴增條帶數及多態性條帶數為篩選條件，從24條 ISSR引物中共篩選出12條較適宜虉草分子標記的引物(表 4)。這12條引物平均擴增總條帶數16條，平均多態性條帶數14.4條，平均多態百分率89.81%。

圖6　引物UBC810對22個不同產地虉草材料的擴增Fig.6　UBC810 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

圖7　引物UBC818對22個不同產地虉草材料的擴增Fig.7　UBC818 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

圖8　引物UBC826對22個不同產地虉草材料的擴增結果Fig.8　UBC826 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

圖9　引物UBC842對22個不同產地虉草材料的擴增結果Fig.9　UBC842 primer amplification for 22 Phalaris arundinacea materials

引物編號擴增總條帶數多態性條帶數多態百分率/%UBC8081818100.00UBC809171588.24UBC810161593.75UBC8111515100.00UBC815151280.00UBC818181583.33UBC820171694.12UBC8261414100.00UBC834141285.71UBC83513969.23UBC8411717100.00UBC842181583.33Total192173-Average1614.489.81

3　討論與結論

ISSR-PCR 反應體系主要受Mg2 +、dNTP、模板DNA、引物和Taq酶5個因素濃度的影響[13-17]。dNTP 是 PCR 擴增的原料，對條帶的擴增有很大影響。試驗表明，dNTP濃度過低而過早消耗完會導致產物單鏈化，進而在電泳檢測時出現雜帶，產率下降，擴增產物不完全；其濃度過高會導致PCR產生錯誤摻入，出現非特異性擴增。試驗表明，在20 μL的反應體系中，1.5 μL dNTP時擴增效果最好。

TaqDNA聚合酶的種類以及用量直接影響擴增反應成功與否。TaqDNA 聚合酶受酶活性、耐熱性及反應體積等因素的限制，使用量大容易產生非特異性擴增產物的積累，雜帶過多，還會造成經濟上的浪費。酶含量過低，易造成產物條帶模糊不清晰難以讀帶；擴增的帶數隨聚合酶濃度的增加可而增加。但酶量過高，反而引起PCR擴增效果的降低。結果表明，20 μL的反應體系中，TaqDNA 聚合酶為0.3 μL時擴增效果最好。

引物濃度影響ISSR-PCR擴增產物的質量和帶型的產生。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，增加引物二聚體的形成幾率[13]。引物濃度過低則擴增出的條帶不完全，不能進行有效擴增。結果表明，在20 μL的反應體系中，引物為1.5 μL時擴增效果最好。

適宜的模板量是確保獲得特異性擴增的要素之一[14]。模板濃度過低，擴增條帶將很弱甚至沒有；濃度過高，會增加非專一擴增產物或造成彌散型產物，影響擴增重復性。試驗優化模板DNA濃度為50 ng。

在ISSR擴增中，退火溫度和循環次數對擴增結果好壞具有明顯影響。退火溫度過低，容易出現背景重，彌散的條帶且擴增產物少；退火溫度過高，則引物與模板結合差，容易造成非特異性擴增，產物的豐富度降低[16，23]。試驗所選12條引物的退火溫度在52～56℃，不同的引物有其適宜的退火溫度，只有在適宜溫度下才能達到良好的擴增效果。

對ISSR反應影響較大的4個因素進行了優化，建立了虉草基因組DNA的ISSR-PCR擴增最佳反應體系。在20 μL反應體系中，TaqDNA聚合酶0.3 μL，10×PCR Buffer(mg2+plus) 2 μL，dNTP 1.5 μL，引物1.5 μL，ddH2O 13.7 μL，模板DNA50 ng。虉草ISSR-PCR擴增的程序如下：第1階段，94℃預變性5min；第2階段，94℃變性45 s、退火60 s(退火溫度采用所用引物的最適溫度)、72℃延伸120 s，共進行35個循環；第3階段，72℃延伸10 min。然后在4℃保存。12條引物共擴增總條帶數192條，其中，多態性條帶數173條，多態位點百分率89.81%。該反應體系的建立可為虉草遺傳多樣性分析奠定技術基礎。

[1]M Hammad Nadeem Tahir,Michael D Casler,Kenneth J Moore，etal.Biomass yield and quality of reed canarygrass under five harvest management systems for bioenergy production[J].Bioenergy Research,2011,4:111-119.

[2]張永亮,駱秀梅.虉草的研究進展[J].草地學報,2008,16(6):659-666.

[3]叢麗麗.虉草耐鹽性鑒定及P5CS基因克隆[D].成都:四川農業大學,2012.

[4]張永亮,聶微微,任秀珍,等.復鹽脅迫下二種虉草K+、Na+吸收與運輸的特點[J].中國草地學報,2010,32(3):28-33.

[5]張永亮,王學愿,劉楊,等.鹽脅迫下氮磷鉀肥對虉草離子吸收與分布的影響[J].草地學報,2014,22(6):1318-1323.

[6]張永亮,張浩.行距與氮肥對虉草分蘗和產量的影響[J].中國草地學報,2013,32(2):43-47.

[7]張永亮，駱秀梅，張浩，等.行距與氮肥對通草1 號虉草生長特性的影響[J].中國草地學報，2014， 36(1):44-48.

[8]賈蘊琪.虉草遺傳連鎖圖譜構建與種質資源評價[D].北京:中國農業大學，2014.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics， 1994， 20:176-183.

[10]張雪，劉青松，師文貴，等.25份無芒雀麥種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].中國草地學報，2014，36(3):104-107.

[11]余國輝，王贊，王俊娥，等.東方山羊豆種質資源遺傳多樣性ISSR分析[J].中國草地學報，2014， 36(3):22-27.

[12]郭郁頻,任永霞,張穎超,等.早熟禾種質資源ISSR遺傳多樣性分析[J].中國草地學報,2014,36(3):28-34.

[13]王方,袁慶華.冰草ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].草地學報,2009,17(3):354-357.

[14]盧玉飛,蔣建雄,易自力.中國芒屬植物ISSR-PCR擴增反應體系的優化[J].草地學報,2013,21(1):167-173.

[15]胡鳳榮,王斐,王志強,等.風信子 ISSR-PCR 體系的優化及引物篩選[J].分子植物育種,2013,11(1):139-144.

[16]富新年,師尚禮,王贊,等.百脈根ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].草原與草坪,2012,32(3):49-57.

[17]楊水蓮,劉衛東,馬 濤,等.假儉草ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].草原與草坪,2009,(1):11-14.

[18]范彥,曾兵,張新全,等.中國野生鴨茅遺傳多樣性的ISSR研究[J] .草業學報,2006,15(5):103-108

[19]Emine A,Ahmet T.The application of ISSR-PCR to determine the genetic relationship and genetic diversity between narrow leaved bluegrass (Poaangustifolia) and rough bluegrass (Poatrivialis) accessions[J].Turk J Biol,2011,35:415-423.

[20]劉新亮.兩種披堿草屬牧草種質資源遺傳多樣性研究[D].北京:中國農業科學院,2011

[21]張曉燕.偃麥草染色體核型與遺傳多樣性分析[D].甘肅:甘肅農業大學,2011

[22]劉美.ISSR標記的早熟禾遺傳多樣性分析[D].蘭州:甘肅農業大學,2009

[23]孟麗娟,趙桂琴.紅三葉ISSR-PCR反應體系的建立與優化[J].草原與草坪,2015,35(2):21-26

Optimization of ISSR-PCR reaction system and primer selection forPhalarisarundinacea

ZHANG Yong-liang， LIU Peng，LUO Xiu-mei,LIU Yang

(InnerMongoliaUniversityforNationalities，Tongliao028042，China)

Genomic DNA extracted from 22Phalarisarundinaceamaterials was used as template for ISSR-PCR to study the impact of dNTPs concentration,template DNA,primer andTaqpolymerase in PCR system by using a single factor experiment method in order to establish the optimized ISSR-PCR reaction system.The results showed that the best reaction system was 2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTPs (2.5 mmol/L),1.5μL primer (10 pmol/μL),0.3 μLTaqpolymerase (5 U/μL),50 ng template,and ddH2O to 20μL at last.Base on this PCR system,24 primers were selected,in which,12 primers showed high polymorphism and repeatability.The suitable annealing temperature of primer 808,809,811,815,818,820,826 was 55℃,and it was 56℃ for primer 835,841 and 842,52℃ and 54℃ for primer 810 and 834 respectively.A total of 192 bands were amplified from 12 ISSR primers，in which,173 were polymorphic loci，the average percentage of polymorphic band was 90.62%.The reaction system would provide the basis for the diversity analysis ofPhalarisarundinaceawith ISSR markers.

Phalarisarundinacea;ISSR-PCR reaction system;primer selection

2015-12-16；

2016-01-03

內蒙古自然科學基金(2015MS0337)；內蒙古民族大學市校合作項目(SXYB2012077)資助

張永亮(1959-)，男，內蒙古包頭人，教授，博士，主要從事牧草栽培與種質資源評價研究。

E-mail：zyl8802@163.com

S 543；Q 786

A

1009-5500(2016)03-0001-07