雷公藤內酯醇對大鼠大腦皮質內注射β-淀粉樣蛋白后樹突棘和發育調節腦蛋白表達的影響

聶　菁　周　明　魯純糾　呂　誠

(南昌大學江西醫學院解剖學教研室，江西　南昌　330006)

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雷公藤內酯醇對大鼠大腦皮質內注射β-淀粉樣蛋白后樹突棘和發育調節腦蛋白表達的影響

聶菁周明魯純糾呂誠

(南昌大學江西醫學院解剖學教研室，江西南昌330006)

〔摘要〕目的探討雷公藤內酯醇對大鼠大腦皮質內注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)后樹突棘和發育調節腦蛋白(drebrin)表達的影響。方法30只SD雄性大鼠隨機分成對照組、Aβ組、用藥組(每組10只)。Aβ組大鼠雙側大腦皮質各一次性注射凝聚態Aβ1～40，對照組大鼠大腦皮質注射等量生理鹽水，用藥組大鼠在大腦皮質注射Aβ1～40后每日腹腔注射雷公藤內酯醇(0.4 mg/kg)，共30 d。Golgi染色和免疫組織化學染色檢測各組大鼠大腦皮質神經元樹突棘的密度和drebrin的表達。結果Golgi染色顯示，Aβ組大鼠大腦皮質神經元樹突棘密度明顯低于對照組(P<0.01)，用藥組大鼠大腦皮質神經元樹突棘密度明顯高于Aβ組(P<0.05)。免疫組織化學染色顯示，Aβ組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒平均光密度較對照組明顯減少(P<0.01)；用藥組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒平均光密度較Aβ組明顯增加(P<0.01)。結論雷公藤內酯醇能抑制Aβ所致drebrin的丟失，減輕Aβ所致樹突棘的損傷。

〔關鍵詞〕雷公藤內酯醇；β-淀粉樣蛋白；發育調節腦蛋白；樹突棘

β-淀粉樣蛋白(Aβ)是阿爾茨海默病(AD)的主要神經病理特征老年斑的核心成分〔1〕。研究表明，Aβ在腦內的沉積可激活小膠質細胞，激活的小膠質細胞能分泌、釋放多種免疫炎性產物，導致神經元變性、死亡〔1〕，并使突觸的結構和功能受損〔2〕。因此，抑制AD腦內的免疫炎癥反應有可能成為治療AD的潛在途徑。雷公藤內酯醇具有較強的抗炎、免疫抑制作用，且能透過血腦屏障〔3〕。近年來的研究表明，雷公藤內酯醇可以改善AD模型動物的學習記憶能力，具有明確的神經保護作用〔4〕。我們的前期工作表明，雷公藤內酯醇能緩解Aβ誘導的樹突棘退化〔5〕，但其作用機制尚不清楚。

樹突棘的主要細胞骨架成分是肌動蛋白，樹突棘形態的改變是通過樹突棘內肌動蛋白的重排而實現的〔6〕。發育調節腦蛋白(drebrin)作為一種神經元特異性的肌動蛋白結合蛋白，可通過改變細胞骨架的理化性質影響樹突棘及突觸的形態和功能，在樹突棘肌動蛋白的重排中起著重要的調節作用〔6〕。本實驗擬觀察雷公藤內酯醇對大鼠大腦皮質內注射Aβ后樹突棘和drebrin表達的影響，從樹突棘結構重塑的角度探討雷公藤內酯醇治療AD的作用機制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器Aβ1～40(sigma公司)，雷公藤內酯醇(純度為99.8%，批號070929，福建省醫學科學研究所，溶于4%丙二醇溶液中，經200目過濾器濾過除菌后備用)。小鼠抗drebrin單克隆抗體(abcam公司)，SP免疫組化試劑盒(Zymed公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)，硝酸銀(上海申博化工有限公司)，重鉻酸鉀(汕頭市西隴化工廠)，5%火棉膠(天津化學試劑有限公司)，Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(Media Cybernetics公司)，江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀(上海川沙花木農機廠)，電腦快速恒溫冷凍切片機(金華市益迪醫療設備廠)。

1.2實驗動物和分組30只體重250～275 g的SD雄性大鼠(南昌大學實驗動物科學部提供)隨機等分成對照組、Aβ組、用藥組，每組10只。用無菌生理鹽水將Aβ1～40稀釋成5 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變為凝聚態的Aβ1～40。Aβ組和用藥組動物麻醉后固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上，參照包新民等的《大鼠腦立體定位圖譜》用微量注射器向雙側大腦皮質(定位坐標為前囟后3.0 mm，雙側旁開2.0 mm，硬腦膜下1.5 mm)緩慢注入凝聚態Aβ1～402 μl，留針10 min，以使Aβ充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口。對照組注入等容積生理鹽水，其余操作步驟同上。用藥組每日腹腔注射雷公藤內酯醇0.4 mg/kg，共30 d。對照組和Aβ組腹腔注射等容積的4%丙二醇溶液。

1.3Golgi染色藥物干預結束后，每組各取5只動物經升主動脈插管，生理鹽水沖洗后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)300 ml灌注固定，取腦置于上述灌注液中后固定1 w，修整組織塊；將修整好的組織塊投入5%火棉膠中進行表面包被處理；將包被好的組織塊投入3%重鉻酸鉀溶液中，37℃浸泡，24 h換液1次，然后繼續浸泡2 d；將鉻化后的組織塊投入1.5%硝酸銀溶液37℃避光浸染3 d。銀染完成后，將組織塊連續冠狀冰凍切片，片厚60 μm，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每只動物取3張切片，每張切片隨機選擇注射區附近3個胞突顯示較完整的錐體細胞，在1 000倍油鏡下觀察樹突棘，從胞體發出的樹突第1次分支開始，計算60 μm長度范圍內樹突棘的個數，以每10 μm長度的樹突棘個數反映其密度。

1.4組織化學與免疫組織化學染色藥物干預結束后，每組各取5只動物經左心室灌注固定，取腦，在注射區附近連續冠狀冰凍切片，片厚25 μm，相鄰切片分二套，分別進行甲苯胺藍尼氏染色和drebrin免疫組織化學染色。免疫組織化學染色采用SP法：3% H2O2，室溫10 min；10%正常山羊血清，室溫15 min；小鼠抗drebrin單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜；生物素標記羊抗小鼠IgG(1∶100)，室溫30 min；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(1∶100)，室溫30 min；DAB顯色。對照實驗：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，重復上述步驟。每只動物取3張切片，每張切片在注射區附近隨機取互不重疊的3個視野，在顯微鏡下采用Image-Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統測出drebrin免疫組織化學染色陽性產物的平均光密度。

2結果

2.1甲苯胺藍尼氏染色結果對照組大鼠大腦皮質未見明顯神經元損傷；Aβ組大鼠大腦皮質注射點附近局部神經元丟失，并可見大量核小深染、胞質不著色的神經膠質細胞浸潤；用藥組大鼠大腦皮質注射點附近神經元損傷程度減輕，神經膠質細胞浸潤減少。見圖1。

圖1　各組大鼠大腦皮質神經細胞病理形態學觀察(甲苯胺藍尼氏染色，×100)

2.2Golgi染色結果對照組大鼠大腦皮質神經元樹突棘數量多而密集，Aβ組大鼠大腦皮質神經元樹突棘密度明顯低于對照組(P<0.01)，用藥組明顯高于Aβ組(P<0.05)。見表1，圖2。

表1　大鼠大腦皮質Golgi染色和drebrin免疫組織化學染色結果

與對照組相比：1)P<0.01；與Aβ組相比：2)P<0.05，3)P<0.01

圖2　各組大鼠大腦皮質神經元樹突棘(Golgi染色，×1 000)

2.3免疫組織化學染色結果表1、圖3可見，drebrin免疫反

圖3　各組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒(免疫組織化學染色，×100)

應陽性產物為棕黃色點狀顆粒，位于大腦皮質神經氈區。對照組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒染色較深；Aβ組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒染色較淺，與對照組相比，Aβ組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒平均光密度明顯減少(P<0.01)；與Aβ組相比，用藥組大鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性顆粒平均光密度明顯增加(P<0.01)。

3討論

作為突觸后結構的樹突棘，其組分包括肌動蛋白細胞骨架、突觸后致密物和神經遞質受體等，是中樞神經系統興奮性突觸傳遞的原始位點。drebrin是一種與神經元生長和腦發育調節相關的肌動蛋白結合蛋白，主要存在于70%興奮性突觸的樹突棘內，它可與纖維型肌動蛋白結合或解離，影響樹突棘的形態，在神經元樹突棘的形成和重塑中發揮重要作用。在培養的皮層成熟神經元過表達drebrin時，神經元樹突棘的長度明顯增加〔7〕；而抑制drebrin在海馬神經元中的表達則導致樹突棘密度減少〔8〕。這些研究表明drebrin 能促進樹突棘的形成，其可能的作用機制有：① drebrin的氨基末端含有高親和力的肌動蛋白結合域，能競爭性地與纖維型肌動蛋白結合，抑制其他肌動蛋白結合蛋白(如原肌球蛋白、肌球蛋白等)與肌動蛋白的作用，調節肌動蛋白骨架網的動力學，減少樹突棘的回縮；② drebrin的羧基末端含有肌動蛋白聚合啟動子(profilin)的結合域，能募集profilin進入纖絲引起棘的延長〔6〕。將Aβ1～40注射入大鼠海馬內，可導致海馬和皮質樹突棘密度明顯下降〔9〕；免疫細胞化學、ELISA和Western印跡檢測顯示，原代培養的APP/PS1轉基因AD模型小鼠神經元內Aβ積聚的同時，drebrin表達下降〔10〕；免疫電鏡結果顯示，2xKI轉基因AD模型小鼠大腦皮質drebrin免疫反應陽性樹突棘的比例明顯減少〔11〕；病理尸檢結果顯示AD患者腦組織樹突棘數量和drebrin水平明顯下降〔12〕。本實驗結果和上述學者的研究結果一致。結合前述文獻，我們認為Aβ所致的drebrin表達減少可能是樹突棘密度下降的原因之一。Aβ對drebrin影響的機制目前尚不清楚。已有研究表明，大鼠側腦室內注射細菌脂多糖引發的免疫炎癥反應可減少腦組織內drebrin蛋白的水平〔13〕；原代培養的小膠質細胞激活后釋放的免疫炎癥介質可導致培養的神經元drebrin表達下降〔14〕。因此，Aβ所致的drebrin表達減少可能與腦內免疫炎癥有關。

近年來的研究表明，雷公藤內酯醇具有明確的神經保護作用。Wang 等〔4〕發現雷公藤內酯醇能改善5XFAD 轉基因AD模型小鼠的學習記憶能力，減少Aβ在5XFAD 轉基因AD模型小鼠腦內的產生和積聚。我們的前期工作表明，雷公藤內酯醇能緩解Aβ誘導的樹突棘退化〔5〕。本實驗進一步顯示，與Aβ組相比，雷公藤內酯醇有可能通過抑制Aβ誘導的免疫炎癥反應促進drebrin的表達，進而對樹突棘起保護作用。

4參考文獻

1Wang WY，Tan MS，Yu JT，etal.Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in Alzheimer's disease〔J〕.Ann Transl Med，2015;3(10)：136.

2Rao JS，Kellom M，Kim HW，etal.Neuroinflammation and synaptic loss〔J〕.Neurochem Res，2012;37(5)：903-10.

3Zheng Y，Zhang WJ，Wang XM.Triptolide with potential medicinal value for diseases of the central nervous system〔J〕.CNS Neurosci Ther，2013;19(2)：76-82.

4Wang Q，Xiao B，Cui S，etal.Triptolide treatment reduces Alzheimer's disease (AD)-like pathology through inhibition of BACE1 in a transgenic mouse model of AD〔J〕.Dis Model Mech，2014;7(12)：1385-95.

5Wan B，Hu X，Nie J，etal.Effects of triptolide on degeneration of dendritic spines induced by Aβ1～40injection in rat hippocampus〔J〕.Neurol Sci，2014;35(1)：35-40.

6張賽圣，程麗霞，呂誠.肌動蛋白結合蛋白在神經元樹突棘重塑中的作用〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(6)：1688-90.

7Hayashi K，Shirao T.Change in the shape of dendritic spines caused by overexpression of drebrin in cultured cortical neurons〔J〕.J Neurosci，1999;19(10)：3918-25.

8Takahashi H，Mizui T，Shirao T.Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurones〔J〕.J Neurochem，2006;97(1)：110-5.

9Gong X，Lu X，Zhan L，etal.Role of the SNK-SPAR pathway in the development of Alzheimer′s disease〔J〕.IUBMB Life，2010;62(3)：214-21.

10柴繼俠，于劍鋒，陳明軍，等.β-淀粉樣蛋白和drebrin在培養的APP/PS1轉基因小鼠神經元中的表達〔J〕.解剖學雜志，2010;33(4)：502-5.

11Mahadomrongkul V，Huerta PT，Shirao T，etal.Stability of the distribution of spines containing drebrin A in the sensory cortex layer I of mice expressing mutated APP and PS1 genes〔J〕.Brain Res，2005;1064(1-2)：66-74.

12Rao JS，Rapoport SI，Kim HW.Altered neuroinflammatory，arachidonic acid cascade and synaptic markers in postmortem Alzheimer's disease brain〔J〕.Transl Psychiatry，2011;1：e31.

13Kellom M，Basselin M，Keleshian VL，etal.Dose-dependent changes in neuroinflammatory and arachidonic acid cascade markers with synaptic marker loss in rat lipopolysaccharide infusion model of neuroinflammation〔J〕.BMC Neurosci，2012;13：50.

14Jebelli J，Hooper C，Pocock JM.Microglial p53 activation is detrimental to neuronal synapses during activation-induced inflammation：implications for neurodegeneration〔J〕.Neurosci Lett，2014;583：92-7.

〔2015-10-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.30660073)；江西省自然科學基金資助項目(No.20132BAB205085)；江西省教育廳科研基金項目(No.GJJ12078)

通訊作者：呂誠(1968-)，男，教授，碩士生導師，主要從事老年性疾病的基礎研究。

〔中圖分類號〕R749.1+6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2831-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.002

Effects of triptolide on dendritic spines and the expression of drebrin after microinjection of beta-amyloid protein into cerebral cortex in rats

NIE Jing，ZHOU Ming，LU Chun-Jiu，et al.

Department of Anatomy,Jiangxi Medical College of Nanchang University,Nanchang 330006,Jiangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of triptolide on dendritic spines and the expression of drebrin after microinjection of beta-amyloid protein(Aβ) into cerebral cortex in rats.MethodsThirty male SD rats were randomly divided into control,Aβ and triptolide-treated groups(n=10).The Aβ group was given an bilateral injection of aggregated Aβ1～40in cerebral cortex in rats.The control group was given an injection of sterile saline in cerebral cortex.The triptolide-treated group was administered intraperitoneally triptolide(0.4 mg/kg)once daily for 30 days after Aβ1～40injection.Spine density of cerebral cortical neurons was assayed by Golgi staining and drebrin expression of cerebral cortical neurons was assayed by immunohistochemical staining.ResultsThe spine density of cerebral cortical neurons in Aβ group was obviously decreased compared with that of control group(P<0.01)；spine density of cerebral cortical neurons in triptolide-treated group was obviously increased compared with that of Aβ group(P<0.05).The average optical density of drebrin immunoreactive product in cerebral cortex of Aβ group was obviously decreased compared with that of control group(P<0.01)；the average optical density of drebrin immunoreactive product in cerebral cortex of triptolide-treated group was obviously increased compared with that of Aβ group(P<0.01).ConclusionsTriptolide could inhibit the loss of drebrin induced by Aβand alleviate the degeneration of dendritic spines induced by Aβ.

【Key words】Triptolide;Beta-amyloid protein;Drebrin;Dendritic spines

第一作者：聶菁(1982-)，女，碩士，主要從事老年性疾病的基礎研究。