干擾胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白CPEBs對膠質瘤干細胞侵襲力的影響

劉紅林　霍峻峰　劉志軍　陳小兵(通訊作者)

河南大學淮河醫(yī)院神經(jīng)外科　開封　475000

?

干擾胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白CPEBs對膠質瘤干細胞侵襲力的影響

劉紅林霍峻峰劉志軍陳小兵(通訊作者)

河南大學淮河醫(yī)院神經(jīng)外科開封475000

【摘要】目的分析干擾胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein，CPEBs)對膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)侵襲力的影響。方法對GSCs進行原代培養(yǎng)，分為實驗組、對照組及空白組，實驗組接受CPEBs干擾處理，對照組接受空載體轉染，空白組正常培養(yǎng)，通過細胞侵襲實驗比較各組細胞侵襲力的變化。結果通過Western blot檢測可見，siRNA-3對CPEBs干擾效果最佳；顯微鏡下可見，受慢病毒感染的實驗組細胞呈綠色熒光表達，表達率70%以上；Western blot檢測可見，受慢病毒感染的實驗組CPEBs蛋白表達量顯著低于對照組與空白組(P<0.05)；處理48 h后，實驗組細胞凋亡率達到21.43%，顯著高于空白組的0.51%及對照組的1.43%(P<0.05)；MTT檢測結果可見，處理3 d后，實驗組細胞生長速度顯著降低，且低于對照組與空白組(P<0.05)；Transwell侵襲實驗結果示，實驗組細胞穿膜數(shù)量顯著低于對照組與空白組(P<0.05)。結論干擾CBEPs后膠質瘤干細胞生長、增殖、侵襲能力均得到大幅度抑制，為膠質瘤的靶向治療提供了新的靶點研究方向，有望在改善膠質瘤患者預后方面發(fā)揮重要作用。

【關鍵詞】胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白；膠質瘤干細胞；侵襲力

胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein，CPEBs)可通過介導mRNA翻譯影響胞質的多聚腺苷酸化，在控制干細胞發(fā)育、分化、衰老、凋亡等過程中發(fā)揮了重要作用[1]。過往關于CPEBs的研究多集中于其在各類腫瘤組織中的表達情況，但并未對其靶向治療作深入研究[2]。為研究干擾CPEBs能否對細胞侵襲能力有所影響，本文選取膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)進行了實驗，取得可靠的結論。現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1．1實驗材料U87細胞系，由美國菌種保藏中心提供，于常溫下在10%胎牛血清DMEM中原代培養(yǎng)，獲取GSCs細胞球；慢病毒載體選擇pSRL-SIH1-H1-GFP質粒[3]，由天津賽爾生物技術有限公司提供；感受態(tài)細胞選擇大腸桿菌DH5a菌株[4]，由大連Takara生物工程有限公司提供。其他材料等均為我實驗室原有設備。

1．2處理方法

1．2．1慢病毒載體制備：參照文獻CPEBs基因序列及RNA干擾序列設計原則制定RNA干擾靶點序列3個，據(jù)此合成siRNA，并將其分別轉染至U87細胞，利用免疫印跡試驗(Western blot法)選取CPEBs受干擾程度最為顯著的siRNA序列，并依照此序列制DNA Oligo，并使其黏性末端與pSRL-SIH1-H1-GFP質粒載體酶切位點一致[3]。將上述產(chǎn)物轉至大腸桿菌感受態(tài)細胞內，并對其培養(yǎng)物質粒進行克隆抽提、酶切鑒定，測序比對陽性克隆提示慢病毒載體制備成功[5-6]。見圖1。

圖1　慢病毒載體組成情況(包含pSRL-SIH1-H1-GFP、

1．2．2慢病毒感染：將制備成功的GSCs細胞球分為3組，分別為實驗組、對照組及空白組，實驗組接受慢病毒感染，對照組僅接受空病毒載體轉染，空白組行正常培養(yǎng)。慢病毒感染前1 d將各組細胞接種至6孔板中，常溫培養(yǎng)，待細胞融合度超過30%時，將培養(yǎng)液更換為無血清培養(yǎng)基，通過預實驗確認感染復數(shù)(MOI)為15，并據(jù)此向實驗組各孔內加入制備的慢病毒載體，并加入感染增強劑[7-8]，劑量5 μg/mL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)；與此同時，向對照組各孔內加入空病毒載體，其他處理同實驗組。

1．3檢測指標

1．3．1CPEBs表達分析：分別于處理24 h、48 h、72 h、96 h及120 h后提取各組細胞總DNA、總蛋白，并采用逆轉錄法、Western blot法檢測其mRNA、蛋白表達變化[9]，并借助流式細胞術對其細胞周期進行檢測，觀察細胞增殖情況；借助噻唑藍比色分析法(MTT法)對細胞活性進行檢測[10]。

1．3．2侵襲力變化：參照文獻[11]方法對各組細胞侵襲力采用Transwell法進行測定，重復平行實驗3次，取平均值。侵入細胞的細胞核在隨機8個×200視野下進行計數(shù)。

1．4隨訪對2組患者進行1～2 a的隨訪，隨訪中觀察不良反應及復發(fā)情況。

1．5統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用2檢驗，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2．1siRNA干擾效果引物序列設計及其干擾效果比較見表1。通過Western blot檢測可見，siRNA-3對CPEBs干擾效果最佳。見圖2。

表1　siRNA引物序列設計及其干擾效果比較±s)

圖2　Western blot檢測siRNA干擾效果

2．2感染效果顯微鏡下可見，受慢病毒感染的實驗組細胞呈綠色熒光表達，表達率在70%以上。見圖3。

圖3　空白組A與實驗組B細胞綠色熒光表達情況比較(×200)

2．3CPEBs蛋白表達Western blot檢測可見，受慢病毒感染的實驗組CPEBs蛋白表達量顯著低于對照組與空白組(P<0.05)。見表2。

表2　各組細胞CPEBs蛋白表達量比較

注：與實驗組比較，*P<0.05

2．4細胞凋亡率處理48 h后，實驗組細胞凋亡率達21.43%，顯著高于空白組的0.51%及對照組的1.43%(P<0.05)。見圖4。

圖4　各組細胞凋亡率比較

2．5細胞活性變化MTT檢測結果可見，處理3 d后，實驗組細胞生長速度顯著降低，且低于對照組與空白組(P<0.05)。見表3。

表3　各組細胞活性變化比較±s)

注：與實驗組比較，*P<0.05

2．6細胞侵襲能力Transwell侵襲實驗結果示，實驗組細胞穿膜數(shù)量顯著低于對照組與空白組(P<0.05)。見表4。

表4　各組細胞侵襲能力比較±s)

注：與實驗組比較，*P<0.05

3討論

膠質瘤是人體常見的腫瘤之一，目前臨床對于膠質瘤的治療方法較多，但仍無一種療法能夠有效改善患者預后、保證其生存質量[12]，因此，關于膠質瘤發(fā)生機制及其靶向治療方案的研究是目前臨床討論的重點[13]。CPEBs近年來在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)高表達，且與學習、記憶有關，提示CPEBs除能夠介導干細胞發(fā)育、細胞分化、細胞衰老及突觸可塑性等過程外，還可能參與了神經(jīng)性疾病的逐代遺傳[2，14]。

膠質瘤影響患者預后的主要原因為其具有較高的侵襲、浸潤性，因此，單純手術治療往往無法達到根治的目的，而抑制膠質瘤干細胞的遷移被認為是改善患者預后的重點[15]。CPEBs是一組高度保守的RNA結合蛋白，在誘導多聚腺苷酸化的翻譯過程中發(fā)揮了重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，過表達的CBEPs對腫瘤細胞的生長發(fā)育和新生血管生成具有極強的促進作用[1，9]，因此，本文以抑制CBEPs為主要方案進行了實驗研究，并發(fā)現(xiàn)以慢病毒感染siRNA-3序列可取得良好的感染效果。慢病毒具有宿主范圍廣、外源基因表達規(guī)律的特點，在目前的基因治療研究中逐漸得到更為廣泛的應用[3]，我們構建了CBEPs RNA干擾慢病毒表達載體，發(fā)現(xiàn)其在轉染后能夠形成十分穩(wěn)定的siRNA，且實驗組綠色熒光細胞表達率超過70%，說明載有特異性靶點干擾序列的慢病毒在轉染后取得良好的效果。隨著感染時間的增加，實驗組CBEPs表達率、細胞活性及細胞侵襲能力顯著降低，細胞凋亡率也得到上調，提示對CBEPs的干擾能夠有效抑制膠質瘤干細胞的生長繁殖，有望在臨床膠質瘤的治療中取得一定成效。隨著CBEPs表達的降低，其生物學功能出現(xiàn)明顯改變，主要包括：(1)mRNA翻譯抑制減弱。高表達的CBEPs可通過形成胞質型聚腺苷酸化核糖核蛋白復合物、結合Maskin蛋白兩種途徑保持mRNA的poly A尾巴處于較短狀態(tài)、40S核糖體亞基識別起始密碼子困難，從而影響mRNA翻譯途徑的開始，無法保證mRNA的翻譯輸出[1]。(2)mRNA翻譯激活減弱。CBEPs在延長poly A尾巴的同時增加了mRNA的長度，從而促進休眠mRNA的激活、翻譯，引發(fā)細胞級聯(lián)信號的出現(xiàn)，誘發(fā)非正常mRNA翻譯的發(fā)生。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，CBEPs在細胞衰老、突觸可塑性中發(fā)揮的作用使得細胞多個生命過程發(fā)生變化[16-17]，這也是導致細胞發(fā)生癌變、癌變惡化的重要原因之一，因此，可以認為，CBEPs在膠質瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉移等多個過程中均發(fā)揮重要作用，隨著關于CBEPs研究的進一步深入及其機制的進一步闡述，相信對于CBEPs的控制將會在今后腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，干擾CBEPs后膠質瘤干細胞生長、增殖、侵襲能力均得到大幅度抑制，為膠質瘤的靶向治療提供了新的靶點研究方向，有望在改善膠質瘤患者預后方面發(fā)揮重要作用。

4參考文獻

[1]D'Ambrogio A，Nagaoka K，Richter JD. Translational control of cell growth and malignancy by the CPEBs[J]．Nat Rev Cancer，2013，13(4)：283-290．

[2]Bishnoi M，Chopra K，Kulkarni SK. Differential striatal levels of TNF-alpha，NFkappaB p65 subunit and dopamine with chronic typical and atypical neuroleptic treatment： role in orofacial dyskinesia[J]．Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2008，32(6)：1 473-1 478．

[3]Lee HK，Bier A，Cazacu S，et al. MicroRNA-145 is downregulated in glial tumors and regulates glioma cell migration by targeting connective tissue growth factor[J]．PLoS One，2013，8(2)：e54 652．

[4]Xiao L，Cheng J，Guo J，et al. Screening and cloning genes transactivated by TGF beta 1 in hepatic stellate cells using suppression subtractive hybridization technique[J]．Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2008，16(11)：854-857．

[5]Ji Y，Nie B，Li P，et al. Construction of Hsp90beta gene specific silencing plasmid and its transfection efficiency[J]．Front Med China，2007，1(3)：253-257．

[6]Kang Y，Liao WM，Sheng PY，et al. Construction and identification of human bone morphogenetic protein-7 recombinant adeno-associated virus type 2 vector and its expression in bone mesenchymal stem cells[J]．Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2007，45(18)：1 279-1 283．

[7]Equils O，Salehi KK，Cornateanu R，et al. Repeated lipopolysaccharide (LPS) exposure inhibits HIV replication in primary human macrophages[J]．Microbes Infect，2006，8(9/10)：2 469-2 476．

[8]Pomerantz RJ，F(xiàn)einberg MB，Trono D，et al. Lipopolysaccharide is a potent monocyte/macrophage-specific stimulator of human immunodeficiency virus type 1 expression[J]．J Exp Med，1990，172(1)：253-261．

[9]Hansen CN，Ketabi Z，Rosenstierne MW，et al. Expression of CPEB，GAPDH and U6snRNA in cervical and ovarian tissue during cancer development[J]．APMIS，2009，117(1)：53-59．

[10]Karpel-Massler G，Kast RE，Westhoff MA，et al. Olanzapine inhibits proliferation，migration and anchorage-independent growth in human glioblastoma cell lines and enhances temozolomide's antiproliferative effect[J]．J Neurooncol，2014，122(1)：21-33．

[11]Li P，Zhou C，Xu L，et al. Hypoxia enhances stemness of cancer stem cells in glioblastoma： an in vitro study[J]．Int J Med Sci，2013，10(4)：399-407．

[12]Dong J，Huang Q. Targeting glioma stem cells： enough to terminate gliomagenesis?[J]．Chin Med J (Engl)，2011，124(17)：2 756-2 763．

[13]Ahmed AU，Auffinger B，Lesniak MS. Understanding glioma stem cells： rationale，clinical relevance and therapeutic strategies[J]．Expert Rev Neurother，2013，13(5)：545-555．

[14]Fernandez-Miranda G，Mendez R. The CPEB-family of proteins，translational control in senescence and cancer[J]．Ageing Res Rev，2012，11(4)：460-472．

[15]Das S，Srikanth M，Kessler JA. Cancer stem cells and glioma[J]．Nat Clin Pract Neurol，2008，4(8)：427-435．

[16]Burns DM，Richter JD. CPEB regulation of human cellular senescence，energy metabolism，and p53 mRNA translation[J]．Genes Dev，2008，22(24)：3 449-3 460．

[17]Richter JD. CPEB： a life in translation[J]．Trends Biochem Sci，2007，32(6)：279-285．

(收稿 2016-01-15)

基金項目：河南省科技發(fā)展計劃項目(編號：162102310162)

【中圖分類號】Q813

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)15-0021-03