外用傷科藥對運動性慢性骨骼肌損傷及肌細胞IL-6表達影響研究

牛文玉，陳佑學

?

外用傷科藥對運動性慢性骨骼肌損傷及肌細胞IL-6表達影響研究

牛文玉1，陳佑學2

1.銅仁學院體育與健康學院，貴州 銅仁554300;2.首都體育學院，北京 100191

摘要：目的：研究不同外用傷科藥對運動性骨骼肌慢性損傷中肌細胞IL-6表達的影響以及骨骼肌細胞中IL-6在運動性慢性肌組織損傷修復中所發揮的作用。方法：采用體重2.2kg—2.5kg成年雄性新西蘭兔42只，隨機分為對照組、扶他林組、消痛貼組，每組21只。其中每組又分為4、5周組，每組7只。動物采用高電壓低電流刺激儀刺激，使其產生主動的跑跳運動，訓練方案：0.1-0.2s/次(每兩次間隔12s),20min/組(兩組間歇20min)，3組/天，5天/周。訓練結束后分別給4周、5周扶他林組和消痛貼組以不同的外用藥。各組在相應的訓練周(4、5)完成后取左腿腓腸肌內側頭，用4%多聚甲醛固定液保存，進行HE染色及免疫組織化學處理，光鏡觀察肌組織形態變化及細胞中IL-6表達的免疫組織化學圖像分析，計算IL-6平均光密度值。結果：1、隨著訓練時間的推移，骨骼肌細胞IL-6的表達明顯增多；2、外用傷科藥可以降低運動性慢性骨骼肌損傷中細胞的炎癥因子；3、外用傷科藥可以顯著降低運動性慢性骨骼肌損傷中肌細胞IL-6的表達。結論：1、骨骼肌損傷中，肌細胞的炎性因子與肌細胞IL-6的表達存在一定的聯系；2、外用傷科藥對慢性骨骼肌損傷中肌細胞的修復有著較明顯的作用；3、運動性慢性骨骼肌損傷中，不同的外用傷科藥都可以顯著降低骨骼肌IL-6的表達影，二者沒有顯著差別。

關鍵詞：IL-6表達；外用貼藥；作用；運動性肌損傷

IL-6(白細胞介素-6)主要由T細胞、B細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、單核細胞和組織中巨噬細胞所分泌，能夠提高機體非特異性免疫功能，在炎癥反應中起作用的細胞因子，多年來對于IL-6的研究一直在進行。近來很多研究發現，IL-6與運動以及運動引發的骨骼肌組織損傷存在密切的聯系[1-3]。運動量、運動項目、運動強度的不同可以引起血漿中IL-6的表達發生不同的變化。IL-6還可以能在一定程度上反映出骨骼肌組織微細結構的變化，所以將其作為觀察骨骼肌損傷的一個評定指標[4]。

外用消痛貼的主要成分是獨一味、水柏枝等中藥材。臨床多次證明，消痛貼在慢性軟組織損傷的治療中有著較為明顯的作用[5-7]。扶他林軟膏的主要組成是雙氯芬酸納,屬非甾體類抗炎類藥物,有研究證實外用扶他林膏對于炎癥的減輕有著明顯的作用。因此，探討二者在運動性骨骼肌慢性損傷中與肌細胞IL-6之間的相互作用和關系，為IL-6新的應用做基礎性的理論建設。

1材料與方法

1.1實驗對象和分組

實驗對象為體重在2.2kg—2.5kg間成年雄性新西蘭兔42只，購自北京科宇動物養殖中心，實驗動物許可證號：SCKK2009-0005,在中國中醫科學研究院基礎理論研究所實驗動物中心，按照國家標準的兔飼養常規分籠飼養。所有動物隨機分為對照組(n=21)、外用扶他林組(n=21)和外用消痛貼組(n=21),其中每組分別為4、5周組，分組如下：

表1　具體分組情況

1.2運動方案

動物的訓練在中國中醫科學研究院中醫理論研究所動物房進行，依據有關研究運動性骨骼肌損傷的造模方法以及有關文獻和預實驗確定運動方案，采用高壓低流電刺激儀刺激實驗組動物，使其產生跑跳運動，具體方案如下：

每只動物每隔12秒刺激一次，每次刺激時間持續0.1-0.2秒，每天訓練60分鐘，分3次進行，兩次訓練間隔20分鐘。每只兔子每天跑跳約300次，每周連續訓練5天，每天的訓練的開始時間不變。在訓練過程中觀察記錄動物每天的精神狀態、體重變化、進食情況，檢查是否受傷等。

1.3給藥

將外用消痛貼組和扶他林組中4、5周組動物小腿部位毛發剔除，將消痛貼和扶他林軟膏均勻涂抹于該皮膚處，并用紗布纏裹。給藥在每天訓練結束后進行，每日一次，下次訓練前將藥包拆除。

1.4取材

分別在第4、5周訓練結束后，使用空氣栓塞法處死動物后立刻取動物左腿腓腸肌內測頭，分兩塊置入4%多聚甲醛固定液中進行固定。

1.5肌組織HE染色、觀察

將所取標本分別進行常規HE染色處理，并在光鏡下觀察肌細胞、肌細胞核、肌內衣、肌外衣、炎癥細胞等，采用奧林巴斯數碼顯微鏡進行拍照。

1.6免疫組化標本制作及圖像分析

制作免疫組標本，并采用奧林巴斯D3.2圖像處理軟件對片子圖像進行采集，在判定肌細胞IL-6的表達中：棕褐色的區域為表達區，密度的深度、面積與IL-6的表達量呈正相關；

1.7數據處理

隨機取免疫組化圖像5個不同的視野記錄，使用MIAS4.0對所采圖像進行分析(平均光密度值)，得出組織圖片IL-6表達的平均光密度值。采用SPSS17.0軟件對所結果進行處理，用均值±標準差(X±s)表示。不同用藥組間橫向比較采用單因素方差分析法進行(a=0.05)。

2結果

2.1肌細胞形態學比較(光學鏡)

2.1.1橫向比較4周組

4周對照組：細胞間結締組織增生，細胞染色不均，出現紅染，細胞核腫脹，巨噬細胞進出現在壞死、變性或結構被破壞的肌細胞中(圖1)。

圖2　( HE,橫切,400倍鏡)

圖3　(HE,橫切,400倍鏡)

4周扶他林組：呈現單相多灶性炎性細胞浸潤，核固縮明顯，細胞排列較為整齊，染色不均，有顆粒性變性(圖2)。4周消痛貼組：有較少的炎性細胞，未見明顯的炎性細胞浸潤灶，細胞排列較為整齊、致密，染色均勻(圖3)。

2.1.2橫向比較5周組

圖4　(HE,橫切,400倍鏡)

圖5　(HE,橫切,400倍鏡)

圖6　(HE,橫切,400倍鏡)

5周對照組：出現大量的炎性細胞浸潤灶，細胞核腫脹，細胞間隙開始變得模糊不清，細胞腫脹呈現圓形，炎性細胞侵入壞死細胞內，細胞內出現的免疫細胞，細胞變性壞死，結夠不完整(圖4)。相比之下，5周消痛貼、扶他林組有較少的炎性細胞，未見明顯的炎性細胞浸潤灶，細胞排列較為整齊、致密，染色均勻(圖5、6)。

2.2骨骼肌細胞IL-6免疫組織化學圖像分析

2.2.1縱向比較4、5周對照組中不同用藥組肌細胞IL-6平均光密度值的變化

表1　4、5周對照組IL-6平均光密度值橫向比較

*:與4周照組比較P<0.05

研究結果顯示，與4周對照組比較5周對照組肌細胞IL-6平均光密度值顯著升高(p<0.05)。隨著訓練時間的推移，骨骼肌細胞IL-6的表達明顯增多。

2.2.2橫向比較4周組中不同用藥組肌細胞IL-6平均光密度值的變化

表2　4周各組IL-6平均光密度值橫向比較

*:與對照組比較P<0.05 #:與4周扶他林組比較P>0.05

研究結果顯示，與4周對照組相比較，4周扶他林組、消痛貼組肌細胞IL-6的平均光密度值較低，且存在顯著性差異(P<0.05)；與4周扶他林組相比較，4周消痛貼組的肌細胞IL-6平均光密度值無明顯差異(P>0.05)。不同外用傷科藥在以降低慢性骨骼肌損傷中肌細胞IL-6的表達有相同影響，都可以降低其表達。

2.2.3橫向比較5周各組肌細胞IL-6平均光密度值的變化

表3　5周各組IL-6平均光密度值橫向比較

*:與5周對照組比較P<0.01 #:與5周扶他林組比較P>0.05

與5周對照組相比較，5周扶他林組、消痛貼組肌細胞IL-6的平均光密度值較低，且存在顯著性差異(P<0.05)；與5周扶他林組相比較，5周消痛貼組肌細胞IL-6平均光密度值無明顯差異(P>0.05)。在運動性慢性骨骼損傷中，外用傷科藥對肌細胞IL-6的表達有降低作用。

3討論

3.1不同外用藥對骨骼肌形態學變化的影響

外用消痛貼主要的藥學是多種中藥成份組成，在消除、減輕局部炎癥反應，促進受損組織修復方面有著明顯的作用。加之其所采用的藥貼技術，可以將藥物直接覆于受損肌組織，外用效果明顯。外用消痛貼外在急性軟組織損傷中有著明顯的作用，這與局部受損組織的炎癥反應有關。扶他林軟膏的主要組成是雙氯芬酸納,屬非甾體類抗炎類藥物,有研究證實外用扶他林膏對于減輕細胞炎癥反應有著明顯的作用。通過研究同表明，通過對比外用貼藥和外用扶他林發現二者有著相似的藥用價值。

運動性骨骼肌慢性損傷中，不同的外用藥對不同組別肌細胞有著較為明顯的影響。觀察對比用各對照組(4、5周)和各給藥組的肌組織切片，發現：與對照組相比較，扶他林組和消痛貼藥組都有著各自變化的特點。對照組可看到明顯的肌纖維壞死、變性，多發生變性，壞死，肌纖維異染，泡體溶解。從組織中可觀察到機化了的瘢痕組織，壞死肌細胞增多，大量巨噬細胞浸潤、侵入壞死肌細胞，提示肌細胞結構受到破壞，受損程度較為嚴重。扶他林組和外用貼藥組炎性細胞較為減少。這與高楊等人的研究結果是相吻合的，外用消痛貼對于局部的炎癥有著抑制作用[5]。

3.2不同外用藥對運動性骨骼肌慢性損傷中肌細胞IL-6的表達影響

從縱向來看，5周對照組肌細胞IL-6的表達，明顯高于4周訓練組，結合肌組織形態學的觀察結果可知，隨著訓練時間的延長，骨骼肌細胞損傷中的炎癥在增多，同時肌細胞IL-6的表達也在增多。這也就是說運動性慢性骨骼肌細胞損傷中肌細胞IL-6的表達與肌細胞炎癥反應存在一定的聯系。從不同用藥組橫向比較的結果來看，與對照組相比較，消痛貼組、扶他林組肌細胞IL-6的表達值有著顯著性差異。就說明在用藥2周后，扶他林組和消痛貼組相似的效果，都能夠降低肌細胞IL-6的表達水平。

扶他林軟膏的主要組成是雙氯芬酸納,屬非甾體類抗炎類藥物,有研究證實外用扶他林膏對于炎癥的減輕有著明顯的作用。消痛貼主要的藥學成分是獨一味等多種中藥成份，在消除、減輕局部炎癥反應，促進受損組織將復有著明顯的作用。加之其所采用的要貼技術，可以將藥物直接覆于受損肌組織，外用效果明顯。臨床上外用消痛貼對各種急、慢性軟組織損傷都有著較為明顯的療效[8-10]。李敏、何朝永等2008年的研究中，以周istar大鼠作為實驗對象，采用自制撞擊器造成動物急性軟組織損傷，分別給以不同組別的動物不同的藥，通過對比外用消痛貼組和隨機模型對照組動物血漿中TNF-α、IL-1βmRNA表達水平后發現，外用消痛貼組動物血漿中TNF-α、IL-1βmRNA較隨機模型組低，進而得出：外用消痛貼治療急性軟組織損傷的機制可能是通過抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α表達來發揮其抗炎作用[11]。本研究通過光鏡觀察組織的形態學變化，可發現外用消痛貼對于運動性骨骼肌慢性損傷也有著較為明顯的療效。

在運動性骨骼肌慢性損傷中，IL-6在肌細胞中的表達機制還不甚明了，在運動性損傷中的作用也存在著較多的疑問。運動性骨骼肌損傷中，短期(2周)的外用傷科藥對于骨骼肌IL-6的表達有著影響，對運動性骨骼肌慢性損傷有著一定的療效。

4結論

(1)骨骼肌損傷中，肌細胞的炎性因子與肌細胞IL-6的表達存在一定的聯系；

(2)外用傷科藥對慢性骨骼肌損傷中肌細胞的修復有著較明顯的作用；

(3)運動性慢性骨骼肌損傷中，不同外用傷科藥(扶他林與消痛貼)都可以顯著降低骨骼肌IL-6的表達影，二者沒有顯著差別。

參考文獻：

[1]陳佩杰.大強度訓練后機體免疫機能的變化及其和垂體-腎上腺皮質系統的可能關系[J].體育科學,1995,15(2):51- 54.

[2]李驍君,王瑞元.長時間大強度游泳訓練對兒少運動員免疫機能的影響[J]. 北京體育大學學報,2001,24(4)481- 484.

[3]陳秀英.一次急性運動對大鼠血漿白細胞介素-6的影響[J].北京體育大學學報,2000,23(3):347- 348.

[4]王 純,孫君志,王東輝.大鼠運動后不同時相血漿IL-6變化的比較[J].成都體育學院學報,2006,32(4):83-85.

[5]高楊,倪濤,鄔麗婭,等.奇正消痛貼膏治療軟組織損傷的臨床觀察[J].中國中醫骨傷科雜志,2006,14(2):31-32.

[6]王永志,董福慧,鐘紅剛,等.奇正消痛貼膏對兔耳軟組織損傷影響的活體觀察[J].中國骨傷,2008,21(5):356-358.

[7]王銀河，朱麗華.奇正消痛貼膏治療橈骨莖突狹窄性腱鞘炎的臨床療效觀察[J].醫學信息,2010,(32)11:74-75.

[8]李寶俊,丁文元,申勇，張為.奇正消痛貼膏聯合奇正青鵬軟膏治療腰椎退變性骨關節病的中長期療效分析[J].臨床合理用藥,2011,4(8A):27-28.

[9]張華,鄭德超.奇正消痛貼膏治療骨關節炎的療效與安全性[J]. 中國當代醫藥.2011,18(24):118-119.

[10]佟玉廷,張新現.奇正消痛貼膏治療骨性關節炎的療效觀察[J].當代醫學.2011,17(22):134-135.

[11]李敏,何朝勇,陳麗華.消痛貼膏治療急性軟組織損傷實驗研究及其機制探討[J].中華中醫藥雜志.2009,24(9):1241-1243.

第一作者簡介：牛文玉(1985-)，男，山西呂梁人，講師，碩士，研究方向：體育保健康復理論與應用。

中圖分類號：

文獻標識碼：A

文章編號：1005-0256(2016)07-0147-4

doi:10.19379/j.cnki.issn.1005-0256.2016.07.060

Research on The Influence of External Applied Medicine to Exercise-Induced Chronic Skeletal Muscle Injuries and Muscle Cells IL-6 Expression

Niu Wenyu1,Chen Youxue2

Abstract:The thesis aims at discussing the influence of different external applied medicine to muscle cells IL-6 expression in exercise-induced chronic skeletal muscle injuries, as well as the role IL-6 played in exercise-induced skeletal muscleinjury rehabilitation. Methods: Randomly divide 42 adult male New Zealand rabbits weighted from 2.2kg to 2.5kg into 3 groups—control group,voltaren group and pain-relieving paste group, with 7 rabbits per group. And each group is divided into 4-week group and 5-week group. High voltage and low current stimulation is used to stimulate the rabbits to run and jump actively. Training schedule:0.1-0.2s per time with 12s intervals, 20min per set with 20min intervals between sets, 3 sets per day and 5 days a week. After training, use different medicine for voltaren group and pain-relieving paste group (both 4-week and 5-week groups) . Inside muscle heads of left leg gastrocnemius muscles are sampled when the training week finished, preservedin 4% paraformaldehyde and treated with HE dyeing and immunochemistry. Then the change of organelle’s tissue and immunochemical analysis on IL-6 image in cells are observed under light microscope to counts the IL-6average optical density value. Results are as follows：First, inflammatory factors are related with muscle sell IL-6 expression in skeletal muscle injuries. Second, external applied medicine is significantlyeffective for chronic skeletal muscle damage. Third, no significant differences between different external medicines in reducing skeletal sell IL-6 expression.

Key words:IL-6expression; external applied medicine; effect; exercise-induced muscle damage

College of Sport and Health, Tongren University, Tongren 554300, Guizhou,China.