基于RNA-seq技術開發中間偃麥草基因組特異分子標記

崔 雨,鮑印廣,王洪剛,2,李興鋒,2

(1.山東農業大學作物生物學國家重點實驗室,山東泰安 271018; 2.國家小麥改良中心泰安分中心,山東泰安 271018)

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基于RNA-seq技術開發中間偃麥草基因組特異分子標記

崔 雨1,鮑印廣1,王洪剛1,2,李興鋒1,2

(1.山東農業大學作物生物學國家重點實驗室,山東泰安 271018; 2.國家小麥改良中心泰安分中心,山東泰安 271018)

摘要：中間偃麥草(Thinopyrum intermedium,2n=6x=42,JJJSJSStSt或EeEeEbEbStSt)是小麥遺傳改良的重要近緣植物，高抗銹病、白粉病等病害，耐逆性強。開發中間偃麥草基因組特異分子標記對于加快其優異基因向普通小麥中的轉移和利用具有重要意義。為建立快速準確開發中間偃麥草基因組特異分子標記的新體系，首先利用RNA-seq技術對中間偃麥草及其基因組供體二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草的苗期葉片進行轉錄組測序，然后根據測序結果設計EST-SSR引物，對普通小麥、中間偃麥草及其基因組供體材料進行DNA擴增分析，從中篩選鑒定中間偃麥草基因組特異標記。結果表明，在所合成的200對EST-SSR引物中，有75對引物(37.5%)在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草中具有特異擴增，引物多態率較高。說明利用RNA-seq技術開發EST-SSR引物可以高效地用于篩選中間偃麥草基因組特異分子標記，這一技術體系也可應用于其他作物及其近緣物種的特異分子標記開發。

關鍵詞：中間偃麥草；小麥；RNA-seq；特異分子標記

中間偃麥草為多年生野生草本植物，是小麥重要的近緣植物之一，其先后被劃入小麥屬(Triticum)、冰草屬(Agropyron)、偃麥草屬(Elytrigia)和類麥屬(Thinopyrum)。盡管后來顏 濟和楊俊良[1]將其歸入毛麥屬(Trichopyrum)，但是因為習慣的原因，中間偃麥草的名稱一直被延用下來。吉萬全等[2]認為，中間偃麥草染色體組有兩個親緣關系較近的染色體組，可能分別來源于二倍體長穗偃麥草(EeEe)和百薩偃麥草(EbEb)，另外一個染色體組與其他兩個染色體組親緣關系較遠，其原始親本供體可能是假鵝觀草(StSt)。Chen等[3]認為中間偃麥草的染色體組為JJJSJSStSt，原始供體同樣可能為二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草。目前，一般將中間偃麥草染色體組構成表示為EeEeEbEbStSt或者JJJSJSStSt[4]。

中間偃麥草對小麥的“三銹”、白粉病等病害免疫，對小麥黑穗病、葉枯病、根腐病和條紋花葉病等病害高抗，同時又是大麥黃矮病的良好抗源，且易與小麥雜交，因此它已成為小麥遺傳改良中具有重要利用價值的種質資源。國內外不同研究者利用普通小麥與中間偃麥草雜交，目前已創制出一批八倍體、異附加系、異代換系及易位系等小偃麥異染色體系，為小麥遺傳改良提供了豐富的種質材料，并成功將中間偃麥草的多種優異基因轉移到普通小麥遺傳背景當中[5-7]。

小麥遠緣雜交后代材料遺傳組成的精確鑒定是對其優異基因進行開發利用的前提，分子標記的發展為小麥異源種質系的鑒定提供了新的輔助選擇技術，大大提高了小麥異染色體系特別是小片段易位系的選擇效率，為更好地轉移和利用小麥近緣物種有利基因提供了便利[8]。目前一些新技術的應用加快了小麥近緣植物分子標記開發的進程，如陳世強等[9]基于SLAF-seq技術開發出一批長穗偃麥草染色體特異分子標記，代 程等[10]由冰草轉錄組EST序列開發了130個冰草6P特異標記?；诟咄繙y序的RNA-Seq可以快速獲得大量表達基因序列，高效應用于分子標記開發、功能基因發掘、分子機理研究以及轉錄組比較等方面[11-15]。鑒于目前開發或篩選的中間偃麥草特異分子標記多態率較低、數量有限且定位復雜，無法滿足中間偃麥草研究的需求，因此大批量開發中間偃麥草基因組(Ee、Eb、St)特異標記對于豐富中間偃麥草標記數目、明確標記的基因組來源、鑒定小偃麥遺傳組成和分析偃麥草屬內系統關系等有重要意義。本研究利用RNA-seq技術獲得中間偃麥草及其基因組供體二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草的轉錄組數據，擬開發一批特異性強、穩定性高的中間偃麥草基因組EST-SSR標記，旨在為高效地開發中間偃麥草基因組特異分子標記建立新的技術體系，為小偃麥新種質的鑒定和中間偃麥草優異基因的進一步利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料包括中間偃麥草(Thinopyrumintermedium,2n=6x=42,EeEeEbEbStSt或JJJSJSStSt)、二倍體長穗偃麥草(Th.elongatum,2n=2x=14,EeEe)、假鵝觀草(Pseudoroegneriastrigosa,2n=2x=14,StSt)、百薩偃麥草(Th.bessarabicum,2n=2x=14,EbEb)及普通小麥(TriticumaestivumL.,6n=2x=42,AABBDD)中國春和煙農15。其中，中間偃麥草引自原中國科學院西北植物研究所，由李振聲院士提供；假鵝觀草引自中國農業科學院作物科學研究所，由李立會研究員提供；百薩偃麥草引自南京農業大學，由亓增軍教授提供；其余材料均由國家小麥改良中心泰安分中心保存。

1.2RNA-seq及引物設計

所用的轉錄組數據均由中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、假鵝觀草和百薩偃麥草苗期葉片總RNA經IlluminaHiSeqTM2000平臺測序獲得。用Trinity將測序序列進行拼接，以此作為后續分析的參考序列，取每條基因中最長的轉錄本作為unigene。采用MISA(1.0版，默認參數)對unigene進行序列分析，搜索SSR位點，所檢測SSR位點包括單核苷酸重復、二核苷酸重復、三核苷酸重復、四核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復6類，判斷標準為單核苷酸重復不少于10次，二核苷酸重復不少于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復不少于5次。找出SSR位點之后，采用Primer 3(2.3.5版)進行SSR引物批量設計，主要參數設置如下：產物大小100～280 bp，引物長度18～27 bp，GC含量40%～65%，退火溫度57～63 ℃，上下游引物Tm值相差小于5 ℃。

1.3引物篩選及PCR擴增

根據中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、假鵝觀草和百薩偃麥草的EST-SSR數據，每個材料選取50對引物，共計200對，由上海生物工程公司合成。擴增體系(10 μL)：模板DNA(33 ng·μL-1)3 μL、2×PowerTaqPCR MasterMix 5 μL、引物(5 μmol·L-1)2 μL。擴增反應在T100TM(BIO-RAD,USA)PCR儀上進行。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物經8%聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳分離，銀染顯影，拍照分析。

2結果與分析

2.1轉錄組測序及SSR檢測結果

高通量測序(IlluminaHiSeqTM2000)得到的原始數據及利用MISA對unigene進行SSR檢測的結果見表1和圖1。

表1　RNA-seq的基本情況

A：中間偃麥草；B：二倍體長穗偃麥草；C：百薩偃麥草；D：假鵝觀草；Mono:單核苷酸重復；Di:二核苷酸重復；Tri:三核苷酸重復；Tetra:四核苷酸重復；Penta:五核苷酸重復；Hexa:六核苷酸重復

A:Th.intermedium; B:Th.elongatum; C:Th.bessarabicum; D:Ps.strigosa; Mono:Mononucleotide repeat; Di:Dinucleotide repeat; Tri:Trinucleotide repeat; Tetra:Tetranucleotide repeat; Penta:Pentanucleotide repeat; Hexa:Hexanucleotide repeat

圖1不同材料SSR基元的分布

Fig.1Distribution of SSR motifs in different materials

經檢測，在中間偃麥草中搜索到6 033個SSR位點，分布在5 390條unigene中，561條unigene含有1個以上SSR，252條unigene含有復合SSRs，平均每6.55 kb有1個SSR；在二倍體長穗偃麥草中搜索到5 367個SSR位點，分布在4 831條unigene中，456條unigene含有1個以上SSR，194條unigene含有復合SSRs，平均每6.82 kb有1個SSR；在百薩偃麥草中搜索到7 232 個SSR位點，分布在6 299條unigene中，794條unigene含有1個以上SSR，317條unigene含有復合SSRs，平均每5.83 kb有1個SSR；在假鵝觀草中搜索到6 648個SSR位點，分布在5 830條unigene中，708條unigene含有1個以上SSR，301條unigene含有復合SSRs，平均每6.02 kb有1個SSR。

中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草等4個材料的SSR發生頻率(檢出SSR的unigene與總unigene數目之比)分別為8.6%、8.3%、11.6%和9.9%，SSR出現頻率(SSR數目與總unigene數目之比)分別為9.6%、9.3%、13.3%和11.3%，在本試驗中百薩偃麥草及假鵝觀草的SSR檢測效率高于中間偃麥草和長穗偃麥草。從SSR基元類型上來看，三核苷酸重復比例最大，占50.0%左右；從SSR基元的重復次數上來看，重復5～8次的序列占比超過六成，其中二倍體長穗偃麥草達到74.0%。

2.2EST-SSR標記分析結果

在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、假鵝觀草、百薩偃麥草的EST-SSR數據中分別選取50對引物，共計合成200對引物，然后利用中國春、煙農15、中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草及假鵝觀草對新開發的引物進行了多態性驗證。具體結果如下。

2.2.1中間偃麥草EST-SSR的擴增結果

利用50對基于中間偃麥草RNA-seq開發的EST-SSR引物對不同材料進行擴增，共有45對引物可以在不同材料中擴增出清晰的條帶，其中，thinta47等21對引物在中國春、煙農15和中間偃麥草中擴增出相同條帶；thinta19在二倍體長穗偃麥草中擴增出特異條帶；thinta48等23對引物在中國春、煙農15和中間偃麥草間有多態性擴增，可以作為中間偃麥草的特異引物加以利用，在這些特異引物中，thinta8等7對引物在中間偃麥草和百薩偃麥草間擴增出相同條帶，thinta5等6對引物在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間擴增出不同條帶。部分引物擴增結果見圖2。

2.2.2二倍體長穗偃麥草EST-SSR的擴增結果

利用50對基于二倍體長穗偃麥草RNA-seq開發的EST-SSR引物對不同材料進行擴增，共有49對引物可以在不同材料中擴增出清晰的條帶，其中，thelo12等29對引物在中國春、煙農15和二倍體長穗偃麥草中擴增出相同條帶；thelo5和thelo37在百薩偃麥草中擴增出特異條帶；thelo11等18對引物在中國春、煙農15和二倍體長穗偃麥草間有多態性擴增。部分引物擴增結果見圖3。

M:DL2000；1：煙農15；2：中國春；3：中間偃麥草；4：二倍體長穗偃麥草；5：百薩偃麥草；6；假鵝觀草。圖3～5同

M:DL2000; 1:Yannong 15; 2:Chinese Spring; 3:Th.intermedium; 4:Th.elongatum; 5:Th.bessarabicum; 6:Ps.strigosa. The same in fig.3-5

圖2部分中間偃麥草分子標記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴增

Fig.2Amplication inT.aestivumL.,Th.intermediumand its genome donor with part molecular markers fromTh.intermedium

2.2.3百薩偃麥草EST-SSR的擴增結果

利用50對基于百薩偃麥草RNA-seq開發的EST-SSR引物對不同材料進行擴增，共有31對引物可以在不同材料中擴增出清晰的條帶，其中，thbes4等18對引物在中國春、煙農15和百薩偃麥草中擴增出相同條帶；thbes23和thbes42引物在二倍體長穗偃麥草和百薩偃麥草中擴增出相近條帶；thbes33在假鵝觀草中擴增出特異條帶；thbes37等10對引物在中國春、煙農15和百薩偃麥草間有多態性擴增，在這些特異引物中，thbes39等3對引物在中間偃麥草和百薩偃麥草間擴增出相同條帶。部分引物擴增結果見圖4。

圖3　部分二倍體長穗偃麥草分子標記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴增

2.2.4假鵝觀草EST-SSR的擴增結果

利用50對基于假鵝觀草RNA-seq開發的EST-SSR引物對不同材料進行擴增，共有40對引物可以在不同材料中擴增出清晰的條帶，其中，psstr20等20對引物在中國春、煙農15和假鵝觀草中擴增出相同條帶；其中，psstr39引物在百薩偃麥草中擴增出特異條帶；psstr32等19對引物在中國春、煙農15和假鵝觀草間有多態性擴增，在這些特異引物中，psstr17和psstr23引物在中間偃麥草和假鵝觀草間擴增出相同條帶，psstr38和psstr44引物在百薩偃麥草中擴增出特異條帶。部分引物擴增情況見圖5。

圖4　部分百薩偃麥草分子標記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴增

圖5　部分假鵝觀草分子標記在普通小麥和中間偃麥草及其基因組供體中的擴增

通過引物多態性驗證，并利用中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草及假鵝觀草對多態性引物進行基因組歸類統計，最終開發出的中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草基因組特異分子標記數量依次為28個、19個、22個和20個。標記序列見表2。

表2　各材料特異分子標記名稱及序列

(續表2Continued table 2)

材料Materials分子標記Marker引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')分子標記Marker引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')二倍體長穗thelo1F:CGCAACTCACAAGTGATGCCthelo22F:AGATCGACACCGGCAAAAGT偃麥草R:AACACGATAAAGGCAGGCCAR:CCGATGCTCTCACCACGTAATh.elongatumthelo3F:AGCCTCCAGAATGACCTTGCthelo23F:ACAATCGGGTCCAAACAGCTR:CATCATCTTCTTGCTGCCGCR:GAGAAGAACTCCGTGTCCCGthelo6F:CACGTGAGATTCCGCTGAGGthelo34F:GCCCAACTAGTGCACTCAGGR:AGTGGGACTTGTTGGTGAGCR:GCACGTTCCCTAGAAAGGCTthelo7F:GGAGATGATGCCGGTTCTGAthelo39F:TGCTGCTCCTTGCTCTGAAAR:ACATACAGAAGCACGGCACAR:ACTCTCGAGCCCTTCAAGGAthelo8F:ATGAACTGCATCGACTCGCTthelo41F:CCTCTCCCGACCTCTCTCTCR:GCAAAGGATAGAGGGGGCATR:GTGATCACCTCGTTGTTGCGthelo10F:CCTCCCATTCTTGAACGCCTthelo44F:CTTCACTTCGTCGTCCAGCTR:CTTCTTCCTCATGCGCATGCR:CGAGGAGCGTGATGACATGAthelo11F:CCATGATTGTCCGCCTACGAthelo45F:CACTCCACCACTCTGCTTCCR:AACCCCACAACGGAGATCACR:CCTTTCCCTCCATGTGACCCthelo14F:AATGGCCAAACGGGAGAGAGthelo50F:TTTGAGTCTTGGGTCAGGGCR:ACACTAAGCCGGCAATCACAR:TCTTGGTTCTGTGTCGTACCAthelo17F:CACGTCATCAGCTCCACTCAthinta19F:TGAGATGCTCCATGTGGTCTR:AGTTGTCTGGCAGGATGGTCR:GCGTGGTCAACTTGCAGAAGthelo18F:ATCCTCGCCTCTGTCTGCTAR:CGGGAACTTGGAGGCATTCT百薩偃麥草thbes17F:AGGCCCCACTCTCACACATAthinta9F:TGGCGAGGGAACAATCAGAGTh.bessarabicumR:TGCCTTAGCTGTACACTGGCR:CTGCCCCTCCTTTCTAGAAAAthbes19F:GGGCAATCACCACAAACAGGthinta16F:TGGCCTCAGAGCAAAACACAR:CGCAAAGGTTTTTCACTCGGTR:GGCTATCTTACAAGGAGGAGGTGthbes27F:GCACACGCAACGAACTTACAthinta45F:AAGCTGGTGCGGAACTCTTTR:TGGAGAAAGTTGGCATCTCCGR:GCAGAGATGAAAGTAGTACAAGCGthbes36F:CGACACCTGCGCAACATTACthinta46F:CTCCTCCTCCTCTCCTTGCTR:ATGGGTTGGCTGCAAGAAGAR:AGGAGGAGGGGCATGATGTthbes37F:ACGAAACACACGGGGGTATCthinta48F:CGCGGAAGAAATGCCGTATCR:TGCTAGGCACCTGCTAATCGR:CTCTCTCATCTTGGCGTGCAthbes38F:CGTATCCCACGCGCTTTGTAthinta49F:CTCACCGTTGCTCACTGGATR:GCTCATGCGACACAAATCCAR:CATCATCTTCTTGCTGCCGCthbes39F:GAGGAGAAGGTGGTGGAAGCpsstr38F:GACGGCAAGATTATGGCAGCR:AACCGGAGCCATAACCACTGR:CTACACCTGCGTCATCTCCCthbes40F:TGCACCAAGATGAGGAGCAGpsstr39F:GGGAGATGACGCAGGTGTAGR:TGGCATTGCTCTGGTGTCTTR:GGCTCTTGTCAGATCGTGCTthbes41F:AGCTGAACCAACGAGACCTGthelo5F:CCAGCTCAGCGGCAAACTAAR:TGCTGGTGTGGCCACATTATR:GCTTCTCCTTCACCTTCCCGthbes45F:TTATGGTTGGGGGTGATGCCthelo37F:GCTGGTCCATTGGTTTGCTGR:GCCCTTTTGTGAGAGCTGTTR:CTTCGGCCATCCCTCCGGthinta8F:TCATCCTCGAAGACGTGCTGpsstr44F:CGGCTTCGGTTCCTCTTTCTR:CTTCCCACCTCCGACGAAAAR:TCATGCCAGTTGTGAGGGAC假鵝觀草psstr2F:GGAAGGAAGCAAATCGCAGCpsstr23F:TCGCAGCGGTAGTTGTTCTTPs.strigosaR:AAAATCCCTTCCTCGTCCCGR:CGCCACTCGACTTAAACCCTpsstr4F:GTCCTTCCTCTCCGTTGGTGpsstr25F:AGGCGGACATACAAATGGCAR:GCCGTCACACCACACACAR:CTTTCCCTTCTTCTTCTTCCTCTCpsstr6F:CACCTATCCCCGTTCCGTTCpsstr26F:TGTGCACCTGTACTGTGTCGR:AGGCCTTCTTGTCGAAGTCGR:TAAACAATGCCACCGCGAAGpsstr9F:GGAGATCGTGGTACTCGCTGpsstr29F:AACGCAGATGCCCACATACAR:ATGGAGCAGTTGGTGGGATGR:TGTCTATCCCACCTACCCCApsstr11F:CTCCGGTCACCACCTTTTCTpsstr32F:AGGATCAGTGGCCACCTACTR:TGAACCTCCATTGCCTTGGTR:CCTCACAAGCCATGGGATGTpsstr13F:TTACTCTCTGCCACCACCCApsstr38F:GACGGCAAGATTATGGCAGCR:CAAAACGCCAGCCCTACAACR:CTACACCTGCGTCATCTCCCpsstr16F:CTCCTCCTAACAACAGGGCGpsstr43F:GTCCATACGTAGACACACAGCAR:CGCCATTTTATCTGCCTGCCR:AGCTACCACACGTATACGCGpsstr17F:GCAATTTCCGTTGGCCAGAGpsstr44F:CGGCTTCGGTTCCTCTTTCTR:TGGAAAACCAATTACTGCCAACAR:TCATGCCAGTTGTGAGGGACpsstr19F:ACTGACTCATGCTCTCTTCACApsstr47F:CGGCTTCGGTTCCTCTTTCTR:AGGTCCACCTGTTGTTGTCGR:GAGACCAAGGCCAGTGTTCApsstr22F:GCCACTCTGAATCCCGTCTCthbes33F:TACCACCGCCCAGCAAATAGR:TAGCACTGAATCGCCGGATGR:GAAGACGACGAGCGGTACTC

3討 論

3.1基于RNA-seq開發中間偃麥草基因組特異標記的特點

對同一物種EST序列進行SSR搜索時，所得結果可能不同，如小麥的SSR出現頻率為3.2%[16]與4.1%[17]，這是由于不同軟件在搜索SSR時所采取的算法及標準不同，搜索到的結果存在差異；不同物種的SSR出現頻率也有很大差異，如黨參(16.1%)[18]較小麥高出幾倍。本研究中，中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草的SSR出現頻率(9.6%、9.3%、13.3%和11.3%)相比其他禾本科植物，非常適合大批量開發標記。

利用通過高通量測序獲得的中間偃麥草及其基因組供體材料轉錄組數據設計出的200對引物中，共75對引物在中國春、煙農15和中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間具有多態性擴增。僅計算由某材料轉錄組數據開發的引物在該材料中的多態率，所開發引物在中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草及假鵝觀草中的多態率分別達到46.0%、36.0%、20.0%和38.0%，多態率遠高于根據谷類作物的共線性，利用小麥G-SSR引物1 255對、EST-SSR引物3 012對、STS引物 293 對、RAPD引物1 200個產生的多態性引物在中間偃麥草(7.6%)、二倍體長穗偃麥草(7.5%)、百薩偃麥草(7.5%)及假鵝觀草(5.9%)中的多態率(課題組前期試驗)。因此，基于RNA-seq開發EST-SSR具有多態率高、特異性強的特點。有35對引物在中國春和中間偃麥草等材料中沒有穩定的擴增產物，這可能由于采用部分單核苷酸重復序列設計引物、轉錄組EST拼接出現誤差等原因導致。

設計引物采用的序列直接關系引物擴增多態率，中間偃麥草等材料和小麥存在較近的親緣關系，序列有一定的相似性，這會降低特異標記的開發效率，本研究中，44.0%的引物在中國春、煙農15和中間偃麥草等材料間具有相同的擴增片段也印證了這一點。下一步可通過中間偃麥草與小麥EST序列比對，得到中間偃麥草的特異序列，由此設計出的引物應該特異性更高、針對性更強，同時這些特異序列對于偃麥草的分子遺傳和進化研究很有裨益。

3.2中間偃麥草基因組特異標記的應用

利用7個中國春-百薩偃麥草染色體異附加系可以將本研究開發的22個百薩偃麥草特異標記，分別定位于 1Eb到7Eb染色體上，同樣，可以將本研究中開發的其他材料的特異分子標記定位到相關的染色體上，這項工作尚在進行之中。下一步希望通過開發大量的引物并驗證更多新特異分子標記，使其覆蓋到Ee基組、Eb基組及St 基組每一條染色體上，建立Ee、Eb及St基組特異分子標記體系。開發的中間偃麥草特異標記可以應用于鑒定小麥-中間偃麥草小片段易位系或漸滲系以及染色體物理作圖中。

本研究中有122對引物(61.0%)在中國春、煙農15上有穩定的擴增位點，因而也可以作為小麥的分子標記，這進一步豐富了小麥的標記基礎。另外，在特異引物中，有10對引物在中間偃麥草和百薩偃麥草間擴增出相同特異條帶，有2對引物在中間偃麥草和假鵝觀草間擴增出相同特異條帶；還有一些非特異引物在中間偃麥草與其基因組供體間或在二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間擴增出相同條帶。說明中間偃麥草、二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草間有較高的同源性，這對于研究偃麥草屬內的物種親緣關系也有著一定幫助。

通過轉錄組測序和分子標記的驗證，建立了高效開發中間偃麥草特異標記的新方法，開發的標記可應用于小偃麥后代材料遺傳組成的鑒定，加速中間偃麥草優異基因的轉移與利用。

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收稿日期：2015-12-15修回日期：2016-01-22

基金項目：山東省良種工程農業生物資源利用項目

通訊作者：李興鋒(E-mail:lixf@sdau.edu.cn)

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)06-0699-09

Development of Specific Molecular Markers forThinopyrumintermediumUsing RNA-seq Data

CUI Yu1,BAO Yinguang1,WANG Honggang1,2,LI Xingfeng1,2

(1.College of Agronomy,Shandong Agriculture University,Tai’an,Shandong 271018,China;2.Tai’an Sub-center of National Wheat Improvement Center,Tai’an,Shandong 271018,China)

Abstract:Thinopyrum intermedium,one of the important relatives of common wheat,has good tolerance to environmental stress and resistance to diseases such as rust and powdery mildew.Development of specific molecular markers is valuable for transformation and application of the favorable genes from Th.intermedium.In order to develop an efficient method of screening the specific molecular markers in Th.intermedium,the RNA-seq data of Th.intermedium and its genome donors,including Th.elongatum,Th.bessarabicum and Pseudoroegneria strigosa were used for developing EST-SSR markers.Two hundred pairs of EST-SSR primers were synthesized and verified through amplifying different DNA materials,and 75(37.5%) primers have specific amplification in Th.intermedium,Th.elongatum,Th.bessarabicum and Ps.strigosa with good polymorphism.The result indicates that developing EST-SSR primers from RNA-seq would be efficient in screening specific molecular markers of Th.intermedium,which can be used in developing specific molecular markers for other crops and their related species.

Key words:Thinopyrum intermedium; Wheat; RNA-seq; Specific molecular markers

網絡出版時間：2016-05-30

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160530.1535.006.html

第一作者E-mail：cuiyu112311@126.com