茶假眼小綠葉蟬抗聯苯菊酯品系和敏感品系解毒酶活性及增效作用研究

李建宇，史夢竹，傅建煒*，王婷，張志康

茶假眼小綠葉蟬抗聯苯菊酯品系和敏感品系解毒酶活性及增效作用研究

李建宇1，史夢竹1，傅建煒1*，王婷1，張志康2

1. 福建省農業科學院植物保護研究所，福建 福州 350013；2. 湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128

摘要：為了明確茶假眼小綠葉蟬（Empoasca vitis）對聯苯菊酯代謝抗性相關的解毒酶，本研究采用室內生物測定和生化分析方法，比較了假眼小綠葉蟬抗聯苯菊酯品系和敏感品系的 3種解毒酶活性差異，并分析了 3種增效劑對聯苯菊酯的增效作用。解毒酶活性測定表明，茶假眼小綠葉蟬抗聯苯菊酯品系羧酸酯酶（CarE）、細胞色素P450氧化酶O-脫甲基（PNOD）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）比活力都高于敏感品系，3種解毒酶活性分別為敏感品系的 2.09倍、4.34倍和 1.59倍。增效劑磷酸三苯酯（TPP）、增效醚（PBO）和順丁烯二酸二乙酯（DEM）在茶假眼小綠葉蟬敏感品系中的增效比分別為1.04、1.09、1.00，而在聯苯菊酯抗性品系中的增效比分別為 1.80、7.97、1.03。上述結果證明，羧酸酯酶和細胞色素 P450氧化酶活性的增強在茶假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性產生中起到了重要的作用。

關鍵詞：茶假眼小綠葉蟬；聯苯菊酯；抗性；解毒酶；增效作用

假眼小綠葉蟬（Empoasca vitis G?the）以成蟲和若蟲吸取茶樹芽葉汁液，導致茶芽葉生長遲緩，焦邊、焦葉，嚴重影響茶葉的品質和產量［1-2］。由于假眼小綠葉蟬個體小、易隱蔽，且世代重疊嚴重，防治困難，目前仍以化學農藥作為主要防治手段。其中，聯苯菊酯是防治小綠葉蟬的主要藥劑，它屬擬除蟲菊酯類仿生合成殺蟲劑，具有觸殺、胃毒等作用［3］，對茶假眼小綠葉蟬成蟲及若蟲都具有較好的防治效果。但是，由于長期過度使用聯苯菊酯防治，致使假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯產生了不同程度的抗性［4-5］。然而研究假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性機理的報道幾乎沒有。

在靶標抗性、穿透抗性及代謝抗性等多種昆蟲的抗藥性機制中，昆蟲解毒酶代謝能力增強所導致的代謝抗性是昆蟲對殺蟲藥劑產生抗性的重要機制之一［6］，昆蟲體內的解毒酶主要有多功能氧化酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽-S-轉移酶等，與昆蟲對有機氯類、有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等多種殺蟲劑的抗性普遍相關［7-9］。增效劑是一類無生物活性的化合物，能夠抑制或削弱抗性昆蟲體內解毒酶系對農藥的解毒作用，提高藥劑的生物活性，延緩抗藥性，在抗藥機理研究和抗性治理中有很重要的作用［10］。在殺蟲藥劑中添加適量的增效劑，可抑制害蟲代謝酶活性，顯著提高殺蟲效果，對于減少殺蟲劑的用量、降低殺蟲劑的抗性風險以及害蟲的抗藥性治理均有重要意義。

鑒于聯苯菊酯在茶假眼小綠葉蟬防治中的重要作用，本研究檢測了茶假眼小綠葉蟬聯苯菊酯抗性品系的酯酶、谷脫甘肽 S-轉移酶和多功能氧化酶的活性，并測定了增效醚（PBO）、順丁烯二酸二乙酯（DEM）和磷酸三苯酯（TPP）3種增效劑在茶假眼小綠葉蟬抗性品系中對聯苯菊酯的增效作用，初步研究了茶假眼小綠葉蟬對擬除蟲菊酯類殺蟲劑聯苯菊酯產生抗性的生化機理，以期為制定假眼小綠葉蟬田間抗性的延緩和治理方案，以及延長聯苯菊酯制劑的使用壽命提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及寄主

敏感品系：假眼小綠葉蟬于2012年9月采自福建省農業科學院植物保護研究所南通中試基地茶圃，未接觸任何殺蟲劑，繼代飼養于該基地人工氣候室30代以上，于2015年5月測定其對聯苯菊酯的LC50為0.7084 mg·L-1。

抗性品系：2013年5年月釆自福建省建甌市東峰茶園（LC50為33.4274 mg·L-1），在室內用聯苯菊酯篩選了 25代，于 2015年 5月測定其對聯苯菊酯的LC50為67.6722 mg·L-1（表1），抗性倍數達95.53倍。

室內飼養條件為：溫度（26±1）℃，光照周期為 14 h光照、10 h黑暗，相對濕度70%～80%。飼養用茶枝采自福建省農業科學院植物保護研究所南通中試基地茶圃，該茶圃從未施用任何化學農藥和肥料，僅人工除草、澆水。

1.2 試驗儀器及藥劑

TU-1900型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、數顯三用恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）、AG 5805型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、超低溫冰箱（海爾集團）、MD/VersaMax酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

2.5%聯苯菊酯乳油（美國富美實公司）；90%增效醚 PBO、97%順丁烯二酸二乙酯DEM、99%磷酸三苯酯TPP（均購自Sigma-Aldrich公司）；乙二胺四乙酸 EDTA （Biosharp生物科技公司）；二巰基蘇糖醇DTT（北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司）；苯基硫脲、對硝基苯甲醚、還原型輔酶ⅡNADPH（均購自 Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司）。

1.3 毒力測定

聯苯菊酯對茶假眼小綠葉蟬的毒力測定參照NY/T 1154.14—2008方法（浸葉法）［11］并作部分改動：將未被藥劑污染的新鮮茶枝剪成一腋一葉；茶枝浸藥 15 s后取出并自然晾干；將晾干的茶枝插入保濕的花泥中，并置于50 mL（直徑2.5 cm）的離心管中；之后將茶小綠葉蟬成蟲轉移至離心管中的茶葉片上，每管接入10頭茶小綠葉蟬成蟲，蓋上通風的蓋子，防止試蟲逃逸。每處理5次重復，以清水處理為對照。48 h后檢查死亡蟲數，計算死亡率。死亡標準為輕觸蟲體后觀察無任何動靜或其他反應則視為死亡。

1.4 增效劑試驗

3種增效劑PBO、TPP、DEM均采用丙酮溶解，選擇對抗性和敏感品系茶假眼小綠葉蟬無致死作用的最高質量濃度 100 mg·L-1作為增效劑添加的最終濃度，配制不同濃度的聯苯菊酯藥液，按1.3中毒力測定的方法進行增效劑增效作用測定。

增效值用 Bradford［12］的方法計算，增效比（SR）=單一藥劑對假眼小綠葉蟬的LC50值/藥劑加增效劑處理的假眼小綠葉蟬的LC50值。

1.5 酶活性測定方法

1.5.1 細胞色素P450氧化酶活力測定

細胞色素 P450氧化酶（以對硝基苯甲醚為底物，PNOD）活力測定參考Rose等［13］的方法。每個品系取小綠葉蟬試蟲 200頭，冰浴勻漿，勻漿液為0.1 mol·L-1、pH 7.8磷酸緩沖液（含1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1苯基硫脲、20%甘油）。10 000 g·min-1、4℃下離心40 min，取上清液在4℃下保存備用。在96孔酶標板中依次加入100 μL 2 μmol·L-1對硝基苯甲醚、10 μL 9.6 mmol·L-1的NADPH和90 μL酶液，酶促反應在 30℃下進行。用酶標儀在405 nm波長下記錄光密度值，每隔25 s記錄1次，共記錄26次，數據記錄與處理采用SOFTmaxPRO軟件，取光密度值范圍在0～0.2之間的數據計算反應速度，以反應速度表示酶活力（每毫克組織蛋白每分鐘吸光值變化0.001作為一個酶活力單位U）。

1.5.2 谷胱甘肽-S-轉移酶活力測定

谷胱甘肽-S-轉移酶活力采用南京建成生物工程研究所的谷胱甘肽-S-轉移酶測定試劑盒進行測定，測定方法參照試劑盒說明書。本試劑盒包括基質液、20 μmol·L-1GSH標準品以及試劑二、三、四。準確稱取待測樣本0.2 g，按照m（g）∶V（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件機械勻漿，2 500 g·min-1，離心10 min，取上清液待測。不同處理谷胱甘肽-S-轉移酶活力的活性按照測定試劑盒說明書在測定管和對照管中分別加基質液、樣本和試劑二后進行酶促反應，4 000 g·min-1，離心 10 min，取上清2 mL作顯色反應。顯色反應中空白管、標準管、測定管和對照管分別按說明書加入試劑二、標準品、試劑三和試劑四后混勻，室溫靜置15 min后，用分光光度計于412 nm波長處比色。將每毫克組織蛋白在37℃反應1 min，扣除非酶促反應，使反應體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為1個酶活力單位U。

1.5.3 酯酶活力測定

羧酸酯酶活力采用南京建成生物工程研究所的羧酸酯酶活性測定試劑盒進行測定，測定方法參照試劑盒說明書。本試劑盒中試劑一為提取液；試劑二為工作液。按照組織質量（g）與提取液體積（mL）為1∶5～10的比例，加入1 mL試劑一進行冰浴勻漿。15 000 g·min-1，4℃離心 30 min，取上清液待測。在 1 mL比色皿中加入 5 μL蒸餾水作為空白管，測定管則依次加入 5 μL上清液，然后上述管中分別加入 1 000 μL預熱的試劑二，迅速混勻后用分光光度計于450 nm測定10 s和190 s光吸收值，計算酯酶活性。將每毫克組織蛋白在37℃反應，每分鐘催化吸光值增加1，定義為1個酶活力單位U。

2 結果與分析

2.1 TPP、PBO和DEM對聯苯菊酯的增效作用

表 1顯示，聯苯菊酯對茶假眼小綠葉蟬敏感品系和抗性品系的LC50分別為0.7084 mg·L-1和67.6722 mg·L-1。TPP、PBO和DEM在茶小綠葉蟬敏感品系中對聯苯菊酯毒力的增效比分別為1.04、1.09、1.00，而在聯苯菊酯抗性品系中的增效比分別為1.80、7.97、1.03（圖1）。可見，TPP和PBO在茶小綠葉蟬聯苯菊酯抗性品系中對聯苯菊酯的毒力均有明顯的增效作用，而DEM的增效作用不明顯。

2.2 聯苯菊酯抗性品系和敏感品系茶假眼小綠葉蟬的解毒酶活力差異

2.2.1 細胞色素P450氧化酶活性

對茶假眼小綠葉蟬聯苯菊酯品系和抗性品系的細胞色素P450氧化酶活性進行測定，結果見圖2。抗性品系和敏感品系的細胞色素P450氧化酶比活力分別為1.22 U·mg-1和0.28 U·mg-1，差異達顯著水平（F=2281.94， P＜0.0001）；抗性品系的細胞色素P450氧化酶活性是敏感品系的 4.34倍，表明假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性形成可能與其細胞色素P450氧化酶活性的增加有關（圖2）。

表1 TPP、PBO、DEM在假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系中對聯苯菊酯的增效作用Table 1 Synergistic effect of TPP， PBO and DEM in bifenthrin-resistant and susceptible strains of E. vitis

圖1 TPP、PBO和DEM 3種增效劑對聯苯菊酯的增效作用Fig. 1 Synergistic effect of TPP， PBO and DEM on bifenthrin

2.2.2 羧酸酯酶活性

由圖3可以看出，假眼小綠葉蟬抗聯苯菊酯品系和敏感品系的羧酸酯酶活力差異顯著（F=15.35， P=0.0173），抗性品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的 2.09倍。說明假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性形成與羧酸酯酶活性的增強也有一定的關系。

2.2.3 谷胱甘肽-S-轉移酶活性

假眼小綠葉蟬抗聯苯菊酯品系和敏感品系的谷胱甘肽-S-轉移酶活力分別為 82.55 U·mg-1和51.81 U·mg-1（圖4），抗性品系的

圖2 假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系細胞色素P450氧化酶活力比較Fig. 2 Comparison of Cytochrome P450 oxidase activities in E. vitis

圖3 假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系羧酸酯酶活力比較

圖4 假眼小綠葉蟬抗性和敏感品系谷胱甘肽-S-轉移酶活力比較Fig. 4 Comparison of glutathione S-transferase activities in E. vitis

Fig. 3 Comparison of carboxylesterase activities in E. vitis谷胱甘肽-S-轉移酶活性是敏感品系的 1.59倍（F=66.92， P＜0.0001），表明假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性形成與谷胱甘肽-S-轉移酶有一定關系，但是不同品系的活性差異不如細胞色素P450氧化酶活性和羧酸酯酶活性的差異大。

3 小結與討論

本研究表明增效劑TPP、PBO和DEM在假眼小綠葉蟬敏感品系中增效作用不明顯，而在聯苯菊酯抗性品系中 TPP、PBO的增效作用較明顯，DEM則增效不明顯。由于TPP、PBO和DEM分別是羧酸酯酶、細胞色素P450氧化酶和谷胱甘肽-S-轉移酶的抑制劑，因此，細胞色素P450氧化酶和羧酸酯酶的活性變化是假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯產生抗性的原因之一。

細胞色素 P450氧化酶通過酶活性的升高從而降低殺蟲劑的殺蟲效果，表現為昆蟲對有機磷類、擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑產生抗性。這種抗性機制在關于小菜蛾 Plutella xyllostella［14］、煙粉虱Bemisia tabaci［15］、桃蚜Myzus persicae［16］的研究中均有報道。在殺蟲劑的選擇壓力下，昆蟲羧酸酯酶產生了相應的反應，導致抗性昆蟲中羧酸酯酶活性有所增高。羧酸酯酶活性增高引起了褐飛虱 Nilaparvata lugens［17］、棉蚜Aphis gossypii［18-19］對有機磷殺蟲劑抗性的產生。谷胱甘肽-S-轉移酶是昆蟲對外源有毒物質代謝途徑中重要的酶系之一。Rumpf等［20］用氯氰菊酯亞致死劑量處理褐蛉幼蟲后，發現其GST活性明顯增加；小菜蛾對有機磷類殺蟲劑產生抗藥性的重要機制之一就是抗性品系小菜蛾體內GSTs的高活力［21］。本研究結果表明，茶假眼小綠葉蟬聯苯菊酯抗性品系和敏感品系的細胞色素 P450氧化酶和羧酸酯酶活性差異顯著，且PBO和TPP增效作用明顯，說明這兩種酶活性的變化與茶假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性有關。同時，抗性品系中茶假眼小綠葉蟬的谷胱甘肽-S-轉移酶活力也有所增加，但DEM的增效作用不明顯，因此，谷胱甘肽-S-轉移酶與茶假眼小綠葉蟬抗性是否相關有待進一步驗證。

本研究中對假眼小綠葉蟬解毒酶活性的測定是在短期藥劑脅迫下進行的，因此要明確解毒酶是否參與了假眼小綠葉蟬對聯苯菊酯的抗性，還需進一步深入系統地研究。

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中圖分類號：S571.1；S435.711

文獻標識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）03-323-07

收稿日期：2015-11-04

修訂日期：2016-01-19

基金項目：福建省自然科學基金（2013J01112）

作者簡介：李建宇，男，助理研究員，主要從事農業昆蟲與害蟲防治、農藥毒理與生物安全研究。*通訊作者：fjw9238@163.com

Activities of the Detoxifying Enzymes and Synergism in the Bifenthrin-resistant and Susceptible Strains of Tea Leafhopper， Empoasca vitis

LI Jianyu1， SHI Mengzhu1， FU Jianwei1*， WANG Ting1， ZHANG Zhikang2
1. Institute of Plant Protection， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013， China；2. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract:Tea green leafhopper， Empoasca vitis， is the most serious pest in tea gardens. The detoxifying enzyme activities and synergism in the bifenthrin-resistant and susceptible leafhopper were measured via biochemical methods and bioassays to clarify their potential relationship to the resistance of tea leafhopper to bifenthrin. The detoxifying enzyme activity tests showed that the activities of carboxylesterase （CarE）， Cytochrome P450-mediated O-demethylation activity toward p-nitroanisole （PNOD） and glutathione-S-transferase （GST） in the resistant strain were all higher than those in susceptible strain. The activities of the three detoxifying enzymes in bifenthrin-resistant strain were 2.09， 4.34 and 1.59 folds those of the susceptible strain respectively. Synergism tests showed that the synergist ratios of triphenyl phosphate （TPP）， piperonyl buoxide （PBO） and diethyl maleate （DEM） were 1.04， 1.09，and 1.00 folds respectively in the bifenthrin-susceptible strain and 1.80， 7.97 and 1.03 foldsrespectively in the bifenthrin-resistant strain. These results indicate that CarE and PNOD play important roles in bifenthrin resistance oftea leafhoppers.

Keywords：Empoasca vitis， bifenthrin， resistance， detoxifying enzymes， synergism