HPLC法測定鹽酸度洛西汀原料藥中的甲醛含量

2016-07-29 03:37:46王均明伍蔚萍浙江燎原藥業股份有限公司臨海317016

北方藥學 2016年7期

吳　瓊　王均明　伍蔚萍（浙江燎原藥業股份有限公司　臨海　317016）

吳瓊王均明伍蔚萍（浙江燎原藥業股份有限公司臨海317016）

摘要：目的：建立測定鹽酸度洛西汀原料藥中甲醛含量的HPLC方法。方法：利用甲醛可與1，4-二硝基苯肼反應生產甲醛2，4-二硝基苯腙的衍生物的原理，對甲醛衍生物采用HPLC分析，色譜條件：色譜柱為Agilent XDB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-水（60∶40，V/V），等度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長為360nm。結果：甲醛衍生物與待測樣品中未知峰能分開，甲醛檢測限約為0.4ppm。結論：該方法操作簡便、靈敏、穩定可靠，可用于鹽酸度洛西汀原料藥中甲醛含量的檢測。

關鍵詞：甲醛含量鹽酸度洛西汀 HPLC

鹽酸度洛西汀，化學名為（S）-（+）-N，N-二甲基-3-（1-萘氧基）-3-（2-噻吩）-丙胺鹽酸鹽，主治抑郁癥。在鹽酸度洛西汀的生產過程中使用了甲醛溶劑，由于甲醛對人體有危害，已被世界衛生組織確定為致癌和致畸形物質，需要嚴格控制甲醛在原料藥中的殘留量。根據鹽酸度洛西汀的日劑量，企業初步確定對甲醛的限度規定為20ppm。從葛興等［1］對甲醛的幾種測定方法概述中，了解到對甲醛含量的測定方法有分光光度法、色譜法、電化學法以及化學滴定法。在這幾種方法中，色譜法以專屬性、靈敏度高有較大優勢。陳建芬等［2］利用高效液相色譜法對口腔護理產品中的甲醛進行研究，曹國華等［3］采用高效液相色譜法測定了鹽酸四環素原料藥中甲醛含量，筆者借鑒了上述采用高效液相色譜法測定甲醛殘留的文獻以及USP35版鹽酸噻氯匹定［4］的甲醛含量測定方法，即利用2，4-二硝基苯肼在酸性條件下可與含有甲醛的樣品反應，生成甲醛2，4-二硝基苯腙衍生物后，在360nm波長下，對其衍生物用HPLC進行分析，從而獲得甲醛含量方法。通過試驗證明，該方法專屬、穩定、可靠。

1實驗材料

Agilent 1200（包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器、Chemistation色譜工作站）；XS205型電子天平（梅特勒-托利多公司）。

甲醛水溶液（含量為37.3%，ACS級別）、鹽酸度洛西汀樣品（浙江燎原藥業有限公司）；2，4-二硝基苯肼（99.6%，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醛2，4-二硝基苯腙（98%，TCI）；甲醇、乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司）。

2方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1稀釋液：流動相A:流動相B=50∶50（V∶V）。

2.1.2 2N鹽酸溶液：取9mL鹽酸加水稀釋成50mL，即得。

2.1.3 2，4-二硝基苯肼溶液：稱取82.5mg的2.4-二硝基苯肼置于50mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，即得。

2.1.4標準儲備溶液：稱取甲醛水溶液（37.3%）500mg置于100mL量瓶中，精密稱定，用甲醇稀釋至刻度，混勻。

2.1.5標準溶液：移取1.0mL標準儲備溶液置于100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻；再移取1.0mL上述稀釋過的溶液置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，獲得甲醛濃度為1.85μg/mL。

2.1.6樣品溶液：取鹽酸度洛西汀供試品約0.50g，精密稱定，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻。（若有必要可超聲使樣品完全溶解！）

2.1.7衍生空白溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此量瓶中，再移取270μL甲醇至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應40min［4］，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

2.1.8衍生標準溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此量瓶中，再移取270μL標準溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

2.1.9衍生樣品溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸至此量瓶中，再移取270μL供試品溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

2.1.10甲醛2，4-二硝基苯腙溶液：稱取約50mg的甲醛2，4-二硝基苯腙，置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻；再移取此溶液1.0mL至100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，獲得濃度約為5μg/mL的溶液。

2.1.11加樣混合溶液：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液置一10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此量瓶中，再移取270μL供試品溶液和270μL標準溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得。

注：各衍生溶液應在配制好的4h內進樣分析［4］。

2.2色譜條件：Agilent XDB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-水（60∶40，V/V），檢測波長：360nm；流速：1.0mL· min-1；柱溫：30℃；進樣量：10μL；運行時間：38min。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性：確認空白溶劑其他雜質對目標峰的測定干擾。取衍生空白溶液、衍生標準溶液、甲醛2，4-二硝基苯腙溶液、加樣混合溶液進樣測定，圖譜分別見圖1～圖4。

從圖1看出，空白溶液在目標峰甲醛-2.4二硝基苯腙的位置有干擾，估計由試劑2，4-二硝基苯肼試劑本身帶入而無法消除，因此在計算甲醛含量時，需要扣除空白值。

從圖2和圖3可以看出，衍生標準溶液的甲醛衍生物與甲醛2，4-二硝基苯腙的峰保留時間一致，所以判斷RT約10.6min峰是甲醛衍生物即甲醛2，4-二硝基苯腙的色譜峰。從圖4加樣混合溶液色譜圖可看出，樣品中其他雜質峰并未干擾目標峰甲醛-2.4二硝基苯腙，目標峰與后面的一小峰（來源于空白溶液峰）的分離度也能達到1.5，表明該方法專屬性良好。

2.3.2檢測限（LOD）：按照信噪比為3∶1的要求配制目標峰的檢測限溶液（具體配制過程：移取2.0mL的2，4-二硝基苯肼溶液至10mL量瓶中，再取50μL的2N鹽酸溶液至此容量瓶中，再移取3μL標準溶液至此量瓶中，搖勻，室溫下放置反應40min，再加稀釋液至刻度，混勻，即得）。檢測限溶液須連續進樣3針，從Agilent Chemstation工作站圖譜數據獲得3次進樣的信噪比（S/N）分別為3.4，3.5，2.9，其平均值為約3.3，對應的甲醛LOD值約為0.4ppm，對于甲醛要求的限度20ppm來說，此檢測靈敏度滿足要求。

2.4樣品測定：取3批鹽酸度洛西汀樣品，按“衍生樣品溶液”方法操作制備溶液，每批樣品平行制備2份，每份測定1次，記錄色譜圖，具體結果見表1。

甲醛含量計算方式：要求各衍生樣品溶液中甲醛2，4-二硝基苯腙的峰面積（AU）不得超過衍生標準溶液中此峰面積的一半（AS/2），即對應甲醛的限度不得大于20ppm。

具體結果見表1。