厭氧處理對桑葉GABA含量的影響

龔 鑠， 周防震

(湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施 445000)

?

厭氧處理對桑葉GABA含量的影響

龔 鑠， 周防震*

(湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施 445000)

摘要[目的]探討厭氧處理對桑葉中γ-氨基丁酸(GABA)含量的影響，為桑葉中功能性成分的開發利用提供參考。[方法]分別采用CO2厭氧和真空厭氧處理桑葉鮮葉，經殺青、烘干和粉碎后，利用丙酮和AlCl3去除桑葉色素，分光光度法測定桑葉中GABA的含量。[結果]未厭氧處理的桑葉中GABA含量為0.915 mg/g；而CO2厭氧處理4 h，GABA含量達到最高值1.214 mg/g；真空厭氧處理8 h，GABA含量達到最高值1.453 mg/g。[結論]一定時間的CO2厭氧或真空厭氧處理均能顯著提高桑葉中GABA含量，真空厭氧處理可得到更高GABA含量的桑葉。

關鍵詞桑葉；γ-氨基丁酸；厭氧處理

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是哺乳動物中樞神經系統中的一種重要的抑制性神經遞質[1]，廣泛存在于動植物體內，具有降血壓、保持神經安定、改善大腦機能和增強記憶等多種藥理作用[2]，具有較大的開發和利用價值。將普通的鮮茶葉經過一定時間的厭氧處理使谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用下脫去羧基，生成GABA，國內外已有報道，并已有產品銷售。如日本學者通過厭氧和應激處理，使普通春茶中GABA的含量達到2.02 mg/g(干重)，夏茶GABA的含量達到0.86～1.14 mg/g(干重)[3]，而普通加工的茶葉雖然谷氨酸的含量豐富，達到1.78～4.95 mg/g，但GABA含量只為0.2～2.0 μmol/g(干重)[4]，相當于0.02～0.22 mg/g(干重)。

桑葉是桑科植物桑的干燥葉，現代中、西醫把桑葉和桑葉生物制劑作為改善糖尿病及其他各種疑難雜癥的藥物而使用，認為其藥效極為廣泛。研究表明，桑葉干品中GABA平均含量為2 260 mg/kg[5-7]，但有關厭氧處理對桑葉GABA含量影響的研究尚少見報道。筆者以桑葉為材料，探討厭氧處理對桑葉中GABA含量的影響，以期為桑葉中功能成分的開發和利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1.1原料與試劑。桑葉，2015年9月中旬采自湖北民族學院實驗示范中心，樹齡30年左右。PET/PE透明真空包裝袋，河北東光縣立新塑料包裝有限公司；CO2厭氧產氣袋及2.5 L密封罐，日本三菱瓦斯化學株式會社。丙酮、無水三氯化鋁和氫氧化鉀，天津市福晨化學試劑廠；無水乙醇、次氯酸鈉和γ-氨基丁酸標品，國藥集團化學試劑有限公司；重蒸酚，北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉，天津市天達凈化材料精細化工廠。以上試劑均為分析純。

1.1.2主要儀器設備。小型高速冷凍離心機，Eppendorf公司；精密pH計(PHS-4C型)，成都方舟科技開發公司；恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市科興儀器廠；粉碎機，廣東天際電器有限公司；電子天平，上海精天電子儀器有限公司；紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司；移液槍，Eppendorf公司；DZ-280/DZ-300A小型真空包裝機，溫州卓越機電有限公司。

1.2方法

1.2.1桑葉的處理。分別取新鮮桑葉100 g，室溫、真空和CO2厭氧條件下處理0、4、8和12 h。微波(110～115 ℃)殺青1～2 min，每30 s拌勻1次。然后80 ℃干燥至恒重，粉碎后過40目篩，置干燥器備用。各處理重復4次。

1.2.2桑葉中GABA的提取。稱取0.5 g桑葉干樣，加入裝有7 mL丙酮的離心管中，室溫振蕩15 min，8 000 r/min離心15 min，棄上清。分別再加7 mL和5 mL丙酮，重復上述過程，沉淀靜置干燥。待完全干燥后，加水5 mL，50 ℃水浴中振蕩提取2 h，8 000 r/min離心15 min，小心取出上清液(體積為V)，低溫保存備用。

1.2.3桑葉中GABA的含量測定。分別取1 mL樣品提取液，加入2 mol/L的AlCl3溶液50 μL，混勻后室溫振蕩15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清0.5 mL加入1 mol/L的KOH溶液300 μL，室溫振蕩5 min，12 000 r/min離心5 min。分別取上清液300 μL，加0.1 mol/L的四硼酸鈉緩沖溶液500 μL(pH 10.0)，6%的重蒸酚400 μL，混勻后再加入600 μL 5%的NaClO溶液，充分混勻。于沸水浴中加熱10 min，立即置水浴中5 min，待溶液出現藍綠色后，加入2.0 mL 60%乙醇，于645 nm波長處測定吸光值。桑葉中GABA的含量按下式計算：

GABA質量比(mg/g)=C×V/m

式中，C為由直線方程計算的值(mg/mL)；V為樣品提取液的總體積(mL)；m為樣品質量(g)。

1.2.4標準曲線的繪制。準確稱取GABA標準品0.010 g，用蒸餾水溶解，定容至10 mL，配制成不同濃度的標準溶液。分別取1 mL不同濃度的標準液，同“1.2.3”處理。以吸光值為縱坐標，GABA的濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。

2結果與分析

2.1CO2厭氧處理對桑葉GABA含量的影響圖1顯示，CO2厭氧處理桑葉0～12 h，桑葉中GABA含量呈現先增加后減少又少量增加的趨勢，其中處理4 h時GABA含量達到最高值，處理8 和12 h時GABA含量顯著低于處理4 h的GABA含量。

圖1　CO2厭氧處理對桑葉GABA含量的影響Fig. 1　Effects of CO2 anaerobic treatment on the GABA content in mulberry leaf

2.2真空厭氧環境下桑葉GABA的含量及其變化圖2顯示，真空厭氧處理桑葉0～12 h，桑葉中GABA含量呈現先減少后增加，然后又減少的趨勢，其中處理4 h時GABA含量最低，處理8 h時GABA含量達到最高。

圖2　真空厭氧處理對桑葉中GABA含量的影響Fig.2　Effects of vacuum anaerobic treatment on the GABA content in mulberry leaf

2.3標準曲線的繪制以GABA的濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。由圖3可見，GABA含量在0.062 5～1.000 0 mg/mL范圍內，濃度與645 nm波長下的吸光值之間具有良好的線性關系：Y=0.692 88X+0.090 71，決定系數R2=0.995 58。

圖3　GABA標準曲線Fig.3　GABA standard curve

2.4桑葉中GABA含量的測定根據圖3標準曲線計算，未厭氧處理桑葉中GABA的含量為0.915 mg/g ；CO2厭氧處理4 h后桑葉中GABA的含量1.214 mg/g，真空厭氧處理8 h后桑葉中的GABA含量為1.453 mg/g(表1)。

表1厭氧處理桑葉中GABA的含量

Table 1The GABA content of mulberry leaf in anaerobic treatments

處理TreatmentOD645GABAmg/g未厭氧Noanaerobictreatment0.1860.915CO2厭氧4hCO2anaerobictreatmentfor4h0.2251.214真空厭氧8hVacuumanaerobictreatmentfor8h0.2611.453

3結論與討論

高等植物中GABA的合成主要由L-谷氨酸脫羧而來，這一反應由L-谷氨酸脫羧酶催化。研究表明，厭氧處理可激活L-谷氨酸脫羧酶的活性[5]，進而可間接增加植物中GABA的含量。從該試驗結果可以看出，未厭氧處理桑葉中GABA含量為0.915 mg/g，這與夏玉玲等報道的目前生產上主要栽培的23個桑樹品種的GABA含量基本一致[1]。其他文獻報道桑葉中GAGA的含量(2.260 mg/g干重)[6-7]，而該研究中桑葉GABA的含量明顯偏低，原因可能與桑葉品種、樹齡、采摘季節等因素有關系。該研究顯示，真空厭氧處理8 h時桑葉中GABA的含量為1.453 mg/g，CO2厭氧處理4 h時桑葉中GABA的含量為1.214 mg/g，表明這2種厭氧處理均可增加L-谷氨酸脫羧酶的活性，進而顯著增加桑葉中的GABA含量。

有研究指出，當植物受到厭氧、冷激和機械傷害等逆境條件時，體內GABA 含量將顯著增加，其中以低氧厭氧逆境效果最佳[5]。該研究中CO2厭氧條件下，桑葉中GABA含量先增加后減小，可能與CO2厭氧產氣袋吸收密封罐中O2，釋放CO2過程中，早期尚有低濃度O2有關。低氧脅迫條件下，植物通過磷酸戊糖途徑減少有毒物質的積累，生成谷氨酸和GABA以抵御逆境脅迫，調節細胞酸度，在此條件下，谷氨酸脫羧酶活性得到激活，促使谷氨酸向GABA的轉化[8]。而真

空厭氧條件下，桑葉中GABA含量呈現先減少后增加再減少的趨勢，則可能與真空包裝袋中缺氧、低壓、無氧呼吸代謝等諸多因素有關。林智等研究發現，采用真空或CO2處理普通茶，對增加茶葉中GABA含量的效果明顯優于N3厭氧處理，其中真空處理最優，最佳條件為：真空、25 ℃、8 h[9]。綜合比較可以看出，利用CO2厭氧產氣袋吸收密封罐中O2，能較快地提高桑葉中GABA含量；而通過真空包裝袋抽真空造成厭氧環境的處理方式，提高桑葉中GABA含量則可能需要更長的時間，但其提高潛力優于CO2厭氧處理。

參考文獻

[1] 夏玉玲,徐立,楊翠鳳.桑葉中γ-氨基丁酸含量的測定 [J].中國農學通訊，2009,25(20)：209-212.

[2] 張輝,徐滿英.γ-氨基丁酸作用的研究進展 [J].哈爾濱醫科大學學報，2006,6(3)：267-269.

[3] SAWAI Y，YAMAGUCHI Y，MIYAMA D,et al.Cycling treatment of anaerobic and aerobic incubation increase the content of γ-aminobutyric acid in tea shoots [J].Amino acids,2001,20:331-334.

[4] 廖明星.茶葉中γ-氨基丁酸(GABA)富集技術研究[D].南京：南京農業大學,2004.

[5] REGGIANI R，CANTU C A，BRAMBILLA I,et al.Accumulation and interconversion of amino acids in rice roots under anoxia [J].Plant cell physiol,1988,29(6):981-987.

[6] 冀憲領,蓋英萍,陳恒文,等.桑葉中γ-氨基丁酸含量的測定及其影響因素的研究[J].蠶業科學,2007,33(2):176-180.

[7] 金豐秋，金其榮.富含γ-氨基丁酸的桑茶的生理功能 [J].中國食品添加劑,2002(1): 42-43.

[8] CRAWFORD L A，BOWN A W，BREITKREUZ K E,et al.The synthesis of γ-aminobutryric acid in response to treatments reducing cytosolic pH [J].Plant physiology,1994,104(3): 865-871.

[9] 林智,林鐘鳴,尹軍峰,等.厭氧處理對茶葉中γ-氨基丁酸含量及其品質的影響[J].食品科學,2004,25(2):35-39.

基金項目國家級大學生創新訓練計劃項目(201310517007)；2014年度湖北省本科高校“專業綜合改革”試點項目。

作者簡介龔鑠(1994- )，男，湖北恩施人，本科生，專業：生物工程。*通訊作者，副教授，博士，從事天然產物開發研究。

收稿日期2016-04-25

中圖分類號S 888.2

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)15-071-02

Effects of Anaerobic Treatment on GABA Content in Mulberry Leaves

GONG Shuo, ZHOU Fang-zhen*

(School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi, Hubei 445000)

Abstract[Objective] To research the effects of anaerobic treatment on GABA content in mulberry leaves, and to provide references for the development and utilization of functional components in mulberry leaves. [Method] Fresh leaves of mulberry were processed by CO2 anaerobic treatment and vacuum anaerobic treatment. After mulberry leaves were fixed, dried and shattered, acetone and AlCl3 were used to eliminate the pigments effectively. GABA content in mulberry leaves was detected by spectrophotometry method. [Result] GABA content in mulberry leaves without anaerobic treatment was 0.915 mg/g; while after CO2 anaerobic treatment for 4 h, GABA content reached the maximum value of 1.214 mg/g. After vacuum anaerobic treatment for 8 h, GABA content reached the maximum value of 1.453 mg/g. [Conclusion] CO2 anaerobic treatment and vacuum anaerobic treatment in a given time can both significantly enhance the GABA content in mulberry leaves. And vacuum anaerobic treatment make a GABA content more than CO2 anaerobic treatment..

Key wordsMulberry leaf; GABA; Anaerobic treatment