扶正化瘀膠囊的TLC鑒別和丹酚酸B含量測(cè)定方法研究

潘一峰+李慶喆+涂馭斌

摘 要 目的：完善扶正化瘀膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：建立了其主要組分丹參、桃仁和五味子的薄層層析鑒別方法；采用反相液相色譜法（RP-HPLC），在C18色譜柱上，以甲醇-乙腈-水-甲酸（30：10：59：1）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，測(cè)定了丹酚酸B的含量。結(jié)果：薄層圖譜斑點(diǎn)清晰，空白對(duì)照無(wú)干擾。丹酚酸B在4.83～145.05 μg/ml范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。平均回收率（n=9）為99.33%，RSD為1.76%。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，可作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 扶正化瘀膠囊 薄層層析 反相液相色譜 丹酚酸B

中圖分類號(hào)：TQ460.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2016）13-0029-04

Study on the methods for the TLC identification and the content determination of salvianolic acid B and other components in Fuzheng Huayu capsules

PAN Yifeng*， LI Qingzhe， TU Yubin（Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co. LTD.， Shanghai 200942， China）

ABSTRACT Objective： To improve the quality standard for Fuzheng Huayu capsules. Methods： Salviae miltiorrhizaea， Persicae semen， Schisandrae chinensis fructus in these capsules were identified by TLC. The contents of salvianolic acid B were determined by RP-HPLC on a C18 column with a mobile phase of methanol-acetonitrile-water-formic acid （30：10：59：1） at wavelength of 286 nm. Results： The spots on TLC were clear and accurate. The standard curve of salvianolic acid B was linear over the range of 4.83～145.05 μg/ml with an average recovery of 99.33% （RSD 1.76%）. Conclusion： The methods are convenient， reliable and accurate for the quality control of Fuzheng Huayu capsules.

KEY WORDS Fuzheng Huayu capsules； TLC； RP-HPLC； salvianolic acid B

扶正化瘀膠囊是上海中醫(yī)藥大學(xué)王玉潤(rùn)教授、劉平教授和肝病研究所在幾十年臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上研制的抗肝纖維化藥，具有活血祛瘀，益精養(yǎng)肝功能。主要用于乙型肝炎肝纖維化屬“瘀血阻絡(luò)，肝腎不足”證者，癥見(jiàn)脅下痞塊，脅肋疼痛，面色晦暗，或見(jiàn)赤縷紅斑，腰膝酸軟，疲倦乏力，頭暈?zāi)繚?，舌質(zhì)暗紅或有瘀斑，苔薄或微黃，脈弦細(xì)。扶正化瘀膠囊由丹參、桃仁、絞股藍(lán)、五味子、松花粉、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉六味藥組成，于2002年8月獲批新藥證書(shū)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)于2005年轉(zhuǎn)為正式標(biāo)準(zhǔn)[WS3-459（ Z-79）-2005（ Z） ][1]。但是，該標(biāo)準(zhǔn)欠完善，鑒別項(xiàng)目中缺少五味子、桃仁等藥味的鑒別。另外，該標(biāo)準(zhǔn)中用原兒茶醛作為丹參的鑒別，以丹參素鈉作為丹參的含量測(cè)定，而近年的研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B 作為丹參中含量最高的水溶性活性酚酸類化合物，被普遍認(rèn)為是丹參發(fā)揮療效作用的主要物質(zhì)之一， 其對(duì)肝臟抗纖維化有較好的療效，藥理藥效的研究報(bào)道也很多[2-6]；同時(shí)，經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)研究表明，丹酚酸B也是扶正化瘀膠囊入血成分之一[7]。目前中國(guó)藥典中典型的丹參制劑品種有丹參片、復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸、丹參注射液等，鑒于原鑒別標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定的原兒茶醛、丹參素鈉則可能是丹酚酸B的降解產(chǎn)物[8]，因此我們變更以丹酚酸B作為丹參鑒別和含量測(cè)定的依據(jù)。

根據(jù)上述原因，以中國(guó)藥典相關(guān)研究試驗(yàn)方法為參考依據(jù)，我們建立了丹參、桃仁、五味子的薄層鑒別方法和丹酚酸B的含量測(cè)定方法，以便有助于提高該產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料和方法

1.1 材料

扶正化瘀膠囊（上海黃海制藥有限責(zé)任公司），陰性對(duì)照樣品為自制。對(duì)照藥材和對(duì)照品均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)如下：丹酚酸B對(duì)照品（含量測(cè)定用，批號(hào)：111562-200504）； 丹參對(duì)照藥材120923-200610；丹酚酸B對(duì)照品111562-201111；苦杏仁苷對(duì)照品110820-200403；五味子甲素對(duì)照品110764-200408；五味子對(duì)照藥材120922-200606。

硅膠G薄層板和硅膠GF254薄層板、流動(dòng)相所用甲醇、乙腈（色譜純）均購(gòu)自美國(guó)Merck公司；甲酸為色譜純（96%，美國(guó)Tedia公司）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1200，Agilent公司），超聲波清洗器（SK7200LHC，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），電子天平（XP-105，梅特勒-托利多）；色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 TLC鑒別

1）丹參 取扶正化瘀膠囊內(nèi)容物2 g，加水50 ml，加鹽酸0.1 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 ml使溶解，作供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材1 g，同法制備，作為對(duì)照藥材溶液。再取丹酚酸B對(duì)照品，加甲醇制成0.5 mg/ml溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[9]，吸取上述二種溶液各3 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2：3：4：0.5：2）為展開(kāi)劑，展層后取出，晾干，以含2%三氯化鐵的乙醇溶液噴霧，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[10]。

2）五味子 取扶正化瘀膠囊內(nèi)容物5 g，加氯仿20 ml，水浴回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取五味子對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取五味子甲素對(duì)照品，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[9]，吸取上述二種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展層后取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視[10]66。

3）桃仁 取扶正化瘀膠囊內(nèi)容物5 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀? ml溶解，加于D101型大孔吸附樹(shù)脂柱吸附（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm），以水30 ml洗脫，棄去水液，再用20%乙醇30 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干（75～85 ℃），殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。另取桃仁藥材2 g，同法制成藥材溶液。再取苦杏仁苷對(duì)照品，加甲醇制成2 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[9]，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（65∶40∶10）的下層溶液為展開(kāi)劑，展層后取出，晾干，以含10%硫酸的乙醇溶液噴霧，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[10]277。

4）陰性樣品制備 6味藥材（丹參、五味子、桃仁、絞股藍(lán)、松花粉、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉）分別缺丹參、五味子或桃仁，按扶正化瘀膠囊提取工藝進(jìn)行提取，將提取物與輔料配制成的扶正化瘀膠囊陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備，分別用作丹參、五味子或桃仁的陰性對(duì)照。

1.4 丹酚酸B含量測(cè)定

1.4.1 RP-HPLC測(cè)定丹酚酸B

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水-甲酸=30：10：59：1，流速：1 ml/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，進(jìn)行RP-HPLC測(cè)定。

1.4.2 溶液制備

1）對(duì)照品母液 取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加純水制成每1 ml含193.40 μg/ml。對(duì)照品母液依次稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液，含量（μg/ml）分別為：4.83、9.67、19.34、38.68、58.02、77.36、96.70、145.05。

2）供試品溶液 取扶正化瘀膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置25 ml容量瓶中，加入水約20 ml，超聲處理 （功率350 W，頻率50 kHz） 20 min，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3）空白對(duì)照 取五味藥材桃仁、五味子、絞股藍(lán)、松花粉、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉，按扶正化瘀膠囊提取工藝進(jìn)行提取，將提取物與輔料配制成的扶正化瘀膠囊空白樣品0.1 g，按照供試品溶液的制備方法制備。

1.4.3 提取時(shí)間的確定

精密稱定本品研細(xì)后的粉末約0.1 g，按上述供試品溶液的制備方法制備。分別超聲處理10、20、30、40 min，測(cè)定丹酚酸B峰面積。據(jù)計(jì)算，峰面積與稱樣量的比值（A/m）分別為4.478、4.531、4.533、4.531， 其中，超聲10 min的A/m相對(duì)其它時(shí)間較小，而超聲20、30、40 min的A/m相互間較接近，故超聲時(shí)間定為20 min。

1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品，按照供試品溶液的制備方法制備供試液，按含量測(cè)定方法分別測(cè)定6次。

1.4.5 精密度試驗(yàn)

取上述重復(fù)性試驗(yàn)的一個(gè)樣品，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，通過(guò)峰面積計(jì)算精密度。

1.4.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已測(cè)定丹酚酸B含量的供試品（批號(hào)：110101，規(guī)格：0.3 g）9份，每份約0.1 g，精密加入高、中、低濃度的丹酚酸B對(duì)照品溶液，按照上述供試品溶液制備方法制備和測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3次。

1.4.7 穩(wěn)定性考察

取本品，按照供試品制備項(xiàng)下的制備方法制成供試品溶液，分別在室溫放置0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，考察供試品溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.4.8 檢測(cè)限和定量限

分別按信噪比（S/N）等于3和10時(shí)，將相應(yīng)濃度的樣品注入液相色譜儀，確定樣品的檢測(cè)限和定量限。

2 結(jié)果

2.1 3種樣品的TLC鑒別

丹酚酸B、五味子和桃仁的供試品和對(duì)照品在TLC的相應(yīng)的位置上均顯示相同顏色的斑點(diǎn)。專屬性試驗(yàn)表明，不含這3種樣品的陰性對(duì)照無(wú)干擾（圖1）。

2.2 丹酚酸B含量測(cè)定

2.2.1 專屬性試驗(yàn)

供試品和丹酚酸B對(duì)照品的RP-HPLC保留時(shí)間相同，丹酚酸B與其他成分的色譜峰分離良好，而空白對(duì)照在丹酚酸B的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)（圖2） 。

2.2.2 線性關(guān)系的考察

以丹酚酸B（μg/ml）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為Y= 10.64X-11.57，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 96，表明丹酚酸B在4.83～145.05 μg/ml范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，可作為該產(chǎn)品質(zhì)量控制的含量測(cè)定方法。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果表明，RP-HPLC測(cè)定本品中丹酚酸B含量的重復(fù)性良好，RSD%為1.52%（<2%）（表1）。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果表明RP-HPLC測(cè)定丹酚酸B的精密度較好，RSD%為0.17%（<2%）（表2）。

2.2.5 穩(wěn)定性考察

分別在室溫放置0、1、2、4、8、12 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)得的峰面積分別為465.3、467.1、470.8、465.6、467.1和465.0，RSD%為0.46%（<2%），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，RP-HPLC測(cè)定本品中丹酚酸B回收率在95%～102%范圍內(nèi)，平均回收率99.33%，符合《中國(guó)藥典》2015年版四部指導(dǎo)原則9101的要求[9]374。

2.2.7 檢測(cè)限和定量限

分別按信噪比（S/N）等于3和10及進(jìn)樣量10 μl時(shí)，確定樣品的檢測(cè)限和定量限分別為0.5 μg/ml和1.5 μg/ml。

3 討論

原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)丹參中原兒茶醛進(jìn)行鑒別，而原兒茶醛是丹酚酸B的降解產(chǎn)物，因此考慮以丹酚酸B作為對(duì)照進(jìn)行鑒別[7]。薄層鑒別方法的展開(kāi)劑參考了《中國(guó)藥典》2015版一部中丹參鑒別方法[10]。該方法操作簡(jiǎn)便，干擾小，穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

五味子以果實(shí)和種子入藥，有效成分為木脂素類化合物[11]，參照《中國(guó)藥典》2015版一部中五味子藥材的鑒別[10]66，以五味子甲素為對(duì)照品。藥典方法中供試品用氯仿溶解，分離效果和重復(fù)性較差。最后改用甲醇溶解供試品后點(diǎn)樣，操作簡(jiǎn)便，干擾小，分離效果和重復(fù)性都好。

桃仁中化學(xué)成分有苷類（如苦杏仁苷、野櫻苷等），脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、苦杏仁酶、尿囊索酶，精油等，其中苦杏仁苷為主要藥效成分[12-13]，參考其它文獻(xiàn)[14-15]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)供試品的處理，用石油醚、乙醚對(duì)樣品粉末進(jìn)行脫脂；正丁醇、乙酸乙酯對(duì)樣品液進(jìn)行萃取；但TLC顯示溶劑拖尾嚴(yán)重、雜質(zhì)較多，仍無(wú)法有效分離，顯色劑顯色后無(wú)法準(zhǔn)確判斷結(jié)果。最后用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)供試品溶液進(jìn)行純化，并考查了不同乙醇濃度的洗脫液中目標(biāo)成分的含量，最后采用20%乙醇洗脫，硅膠G薄層板展開(kāi)，以氯仿-甲醇-水（65∶40∶10）的下層溶液為展開(kāi)劑，含10%硫酸的乙醇溶液加熱顯色的條件最優(yōu)。

我們統(tǒng)計(jì)了28批規(guī)格為0.3 g和23批規(guī)格為0.5 g扶正化瘀膠囊的丹酚酸B含量數(shù)據(jù)，另外考慮到丹酚酸B在貯存中可能會(huì)氧化或分解，從而含量會(huì)有一定的降低，因此我們認(rèn)為扶正化瘀膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)下的含量限度應(yīng)暫定為每粒膠囊含丹酚酸B不得少于2.10 mg（每粒裝0.3 g）或不得少于3.50 mg（每粒裝0.5 g）較為合適。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委會(huì). 國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)）第68冊(cè)[S]. 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局， 2008： 46-49.

[2] 李雪梅， 李紅山， 胡義楊. 中藥有效組分抗肝纖維化研究進(jìn)展[J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志， 2008， 18（3）： 186-189.

[3] 胡義楊. 中醫(yī)藥抗肝纖維化的研究[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志， 2005， 9（7）： 18-22.

[4] 王蓉， 原永芳. 丹酚酸B藥理作用的研究概況[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2011， 17（4）： 130-132.

[5] 李認(rèn)書(shū)， 李永強(qiáng). 丹酚酸的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2003， 14（6）： 371-373.

[6] 朱金墻， 閆晨， 康立源. 丹酚酸B的穩(wěn)定性及其降解機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中醫(yī)信息雜志， 2010， 17（12）： 113-115.

[7] Yang T， Liu S， Wang CH， et al. Comparative pharmacokinetic and tissue distribution profiles of four major bioactive components in normal and hepatic fibrosis rats after oral administration of Fuzheng Huayu recipe[J]. Pharm Biomed Anal， 2015， 114： 152-158.

[8] 徐德然， 王康才， 王崢濤， 等. 丹參中丹參素、原兒茶醛來(lái)源的初步研究[J]. 中國(guó)天然藥物， 2005， 3（3）： 148-150.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（2015年版） 四部[M]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2015： 57-58.

[10] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（2015年版） 一部[M]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2015： 76.

[11] 仰榴青， 吳向陽(yáng)， 徐佐旗， 等. 五味子及其制劑中木脂素類成分含量測(cè)定的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2005， 30（9）： 650-653.

[12] 許筱凰， 李婷， 王一濤， 等. 桃仁的研究進(jìn)展[J]. 中草藥， 2015， 46（17）： 2649-2655.

[13] 王仁芳， 范令剛， 高文遠(yuǎn)， 等. 桃仁化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2010， 25（6）： 426-429.

[14] 張明光， 孫振瑜， 云青， 等. 小兒咳喘靈沖劑薄層鑒別方法的研究[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志， 2004， 36（11）： 902～903.

[15] 王凌， 陳逸紅. 黃英咳喘糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 19（4）： 54-56， F0003.