響應面法優化中空介孔二氧化硅球包載吲哚美辛的工藝研究

王海媛，孫明輝，任智慧，周芳，晉興華（天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072）

?

研究開發

響應面法優化中空介孔二氧化硅球包載吲哚美辛的工藝研究

王海媛，孫明輝，任智慧，周芳，晉興華
（天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072）

摘要：采用硬模板法在室溫下、中性水溶液中合成了中空介孔二氧化硅球，中空部分直徑為 250nm，外殼厚度25nm。利用氮氣吸附-解吸附、透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜表征了微球的物理化學性質。該微球球形度良好，BET結果顯示其比表面積為730.0m2/g，平均孔容1.084cm3/g，平均孔道直徑6.58nm。利用中空介孔二氧化硅球較好的載藥性能負載吲哚美辛，并采用三因素的Box-Behnke實驗設計對藥物負載處方工藝進行優化研究。當IMC/HMSNs質量比為22:1，超聲1.4h，震蕩吸附23h時實驗條件達到最佳，包封率理論值為85.2%。在此條件進行驗證實驗，吲哚美辛的包封率可達理論預測值的98.7%，說明將 Box-Behnken 實驗設計法用于中空介孔二氧化硅球包載吲哚美辛的優化篩選是可行的，且得到的實驗觀察值與數學模型的預測值相符合。

關鍵詞：中空介孔二氧化硅球；吲哚美辛；Box-Behnken實驗；包封率

吲哚美辛（Indomethacin，IMC），又名消炎痛，是一種非甾體消炎藥，是最強的環氧酶抑制劑之一，具有解熱、抗炎、抗風濕的作用，臨床上主要用于急性風濕性及類風濕性關節炎的治療。此外，有研究表明吲哚美辛具有良好的抗腫瘤作用[1-3]，該藥被認為是比撲熱息痛和阿司匹林更具有發展前景的藥物。吲哚美辛為BCSⅡ類藥物（生物藥分類系統，biophamacecitieal classification system），其脂溶性好，但水溶性極差（5μg/mL，25℃），普通制劑如片劑、膠囊劑、軟膏、栓劑等生物利用度低，且易引發胃腸道損害、肝損害、腎損害及中樞神經疾病，因此研發吲哚美辛新劑型，尋找增加其溶解性和生物利用度的包載材料，提高生物利用度，減少不良反應成為人們關注的主要問題[4]。

中空介孔二氧化硅球（hollow mesoporous silica nanoparticles，HMSNs）作為一種新型載體，兼具空心和多孔微球的雙重優點，其水熱穩定性好、納米級孔道結構完整、孔徑范圍可調、生物相容性好、比表面積大、負載量高[5-6]，特別是在催化[7-8]、藥物裝載和控制釋放[9-13]等方面具有良好的應用前景。實驗采用中空介孔二氧化硅球來包載吲哚美辛以提高藥物溶解性，增加其生物利用度，并利用響應曲面法（response surface methodology，RSM）中的Box-Behnken實驗設計（Box-Behnken design，BBD）對吲哚美辛負載的處方工藝進行優化研究[14-16]。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料與儀器

材料：吲哚美辛、過硫酸鉀，上海晶純實業有限公司；正硅酸乙酯，天津市博迪化工有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、無水乙醇，天津光復精細化工研究所；苯乙烯、4-乙烯基吡啶，北京百靈威科技有限公司，各試劑均為分析純，水為超純水，Milli-Q Academic。

儀器：Agilent Cary 60紫外分光光度計；Anke TGL-16G高速臺式離心機；KE-BEI型電熱恒溫水浴鍋；Mettler toledo XS105型電子天平；SX2-4-10馬弗爐；QT2060超聲清洗機；WH-7401-50B電動攪拌器；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀；JEOL-100CX-II透射電子顯微鏡；Tecnai G2 F20場發射透射電子顯微鏡；V-Sorb4800比表面檢測儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 中空介孔二氧化硅球的合成

在三口燒瓶中，加入去離子水170mL、一定量的4-乙烯基吡啶與苯乙烯（體積比 1∶2），氮氣保護下磁力攪拌30min后加入0.36g過硫酸鉀粉末（K2S2O8），80℃反應24h，得到模板微球（PS-co-P4VP），離心水洗3次，存放于去離子水中。稱取一定量十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）于250mL燒瓶中，加入180mL去離子水、6.8mL正硅酸乙酯，超聲混合后加入10mL模板微球乳液，室溫下攪拌48h，80℃沉積2h，離心乙醇洗滌 3次，自然晾干，得到復合微球PS-co-P4VP@SiO2，馬弗爐中550℃煅燒6h，冷卻至室溫，得到中空介孔二氧化硅球HMSNs。

1.2.2 藥物負載實驗

利用溶劑浸漬法進行中空介孔二氧化硅球的載藥實驗。稱取2.5mg HMSNs加入到5mL、12mg/mL的吲哚美辛乙醇溶液中（IMC/HMSNs質量比為24∶1），超聲1.0h，密封、避光，放入37℃恒溫震蕩器中震蕩18h后，10000r/min離心5min，取上清，用紫外分光光度法 320nm處測定吲哚美辛的吸光度，從而計算HMSNs的包封率。根據式（1）測定吲哚美辛的包封率EE。

式中，EE為吲哚美辛的包封率；M總為加入的吲哚美辛的總質量；M游離為離心后上清液中剩余的吲哚美辛的質量。

1.2.3 實驗設計與數據處理方法

采用Design-Experts 8.0.6軟件中的BBD實驗進行試驗設計與數據分析。以IMC/HMSNs質量比、載藥時間、超聲時間3個因子為自變量，分別以A、B、C表示，以吲哚美辛包封率為響應值（Y），并根據現有實驗條件，在單因素考察的基礎上，確定了各影響因素合適的條件范圍，依次為16∶1～32∶1、12～24h、0.5～1.5h，按照方程x=(X–X0)/?X對自變量進行編碼（x為自變量的編碼值，X為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，?X為自變量的變化步長），并以自變量的編碼值+1、0、–1分別代表自變量的高、中、低水平的編碼值，實驗自變量因素編碼及水平見表1。

2 結果與討論

2.1 中空介孔二氧化硅球的合成與表征

表1 Box-Behnken 實驗自變量因素編碼及水平

雖然許多研究者通過模板輔助的溶膠-凝膠過程成功合成了 HMSNs，但仍無法有效的避免不必要和不規則的聚集體形成。采用直接包覆法制備核殼結構微球過程中會有大量前體或水解產物不能全部包覆在硬模板外面，而以沉淀的形式直接析出。

在本研究中，CTAB表面活性劑和PS-co-P4VP核殼微球作為雙重模板用來形成HMSNs的介孔和空心。選擇 PS-co-P4VP核殼微球作為模板劑，首先是因為包含PS核心和P4VP外殼的模板微球，外層為未成鍵的路易斯堿性P4VP鏈，可以作為催化劑啟動在模板上的 TEOS溶膠-凝膠過程。另一方面，PS-co-P4VP模板微球通過一級無皂乳液聚合可以很容易的合成，這為后續實驗的進行提供了很大的便利和經濟效益。

2.1.1 透射電鏡分析

從PS-co-P4VP、PS-co-P4VP@SiO2和SiO2透射電鏡圖可以看出，中空微球形態完整，殼層均勻，球形度良好，尺寸約為300nm，SiO2外殼為25nm。圖1中(d)為高倍透射電鏡下的微球，從中可以看見明暗相間的孔道。

圖1 不同樣品的透射電鏡圖

2.1.2 氮氣吸附-解吸附

利用氮氣吸附-解吸附方法測定微球的表面積，孔徑分布和孔容量等。HMSNs的吸附-脫附等溫曲線（圖2）屬于IV型等溫線，是介孔材料典型的吸附等溫線。同時，在0.6～1.0的相對氮氣壓范圍內，脫附等溫線和吸附等溫線之間存在一個明顯的滯后環，這表明制備的HMSNs具有介孔結構、相對較窄的孔徑分布。

圖2 氮氣吸附-脫附等溫曲線和孔徑分布曲線

根據HMSNs的吸附-脫附等溫線計算相應的孔徑分布，利用脫附支數據作圖得到介孔材料的孔徑分布圖。1.1nm處的小窄峰，結合吸附支數據考慮是由脫附支的TSE現象引起的假峰，而在2.0～5.0nm處顯示一個狹窄的孔隙大小分布，在 3.29nm處達到峰值，即孔道半徑為3.29nm，直徑6.58nm。BET結果顯示HMSNs比表面積為729.963m2/g，BJH計算得到孔體積為 1.084 cm3/g、平均孔徑為6.58nm。

2.1.3 傅里葉變換紅外光譜

觀察復合微球的紅外光譜圖（圖3中c線）發現，1475cm–1、1397cm–1處存在CTAB中—CH3反對稱變形振動和對稱變形振動；1600～1400cm–1范圍內多處吸收峰為苯環的特征吸收峰，3026cm–1為吡啶環上C—H的伸縮振動，3064cm–1為苯環上環氫的伸縮振動，均為模板微球 PS-co-P4VP的特征吸收峰，紅外特征吸收峰的存在證明了 CTAB和PS-co-P4VP雙重模板功能。

經 550℃煅燒，模板劑的特征吸收峰均消失，僅存SiO2的6個特征峰（圖3中d線）。1087cm–1處的Si—O—Si反對稱伸縮振動，805cm–1、464cm–1處的Si—O鍵對稱伸縮振動和彎曲振動，3447cm–1處的Si—OH反對稱伸縮振動，1632cm–1附近水的H—O—H彎曲振動，967cm–1處的Si—OH的彎曲振動吸收。

對比SiO2（圖3中d線）和PS-co-P4VP@SiO2（圖3中c線）在1087cm–1和967cm–1處的特征吸收峰發現，967cm–1處Si—OH中等強度吸收峰，說明仍有大量Si—OH未縮合成Si—O—Si鍵，硅骨架不牢固；煅燒后的 SiO2微球1087cm–1處吸收峰強度明顯加大，同時 967cm–1處吸收峰強度不斷減小，說明煅燒過程使部分Si—OH縮合成Si—O—Si鍵，增大了硅骨架強度。

圖3 傅里葉變換紅外光譜圖

2.2 HMSNs載藥實驗及BBD設計

綜合考慮，選擇IMC/HMSNs質量比、載藥時間、超聲時間進行單因素實驗，實驗得到的最優條件為IMC/HMSNs質量比24∶1，載藥時間18h，超聲時間1.0h，

2.2.1 實驗設計

該優化實驗采用Design-Experts 8.0.6軟件中的中心組合實驗設計 BBD原理，確定響應面的實驗方案。選取IMC/HMSNs質量比A、載藥時間B、超聲時間C為自變量，以吲哚美辛的包封率為響應值，進行3因素3水平的響應曲面分析實驗。根據單因素實驗結果，以實驗最優值為中心值，設計了17個試驗，其中分析因子試驗12個，零點試驗5個，試驗方案及結果見表2。

采用Design-Experts 8.0.6軟件對實驗結果進行響應曲面分析，利用向后剔除法除去不顯著項。回歸方程為Y=53.05+1.63A+0.09B+7.21C+0.13AC+ 0.13BC–0.04A2–2.73C2，相關系數R2=0.9993，說明二次回歸方程線性相關性良好，方程與實驗結果匹配度高。調整相關系數則用來解釋回歸模型的充分性和適用性，根據自變量個數和樣本量的大小對相關系數進行調整，Adj-R2=0.9993，說明模型預測值與實驗真實值之間具有很高的相關性。

回歸方程各項的方差分析結果見表 3。二次回歸模型的F值為1883.07，P<0.0001，遠小于一般顯著性檢驗規定的α（0.05或0.01），說明該方程顯著性良好。而失擬項F=0.68，明顯小于F0.05[F0.05(3,2)=19.2]，模型擬合度良好；失擬項P=0.6637（>0.01），二次回歸模型失擬度不顯著，說明模型擬合效果好，試驗誤差小，不存在失擬因素，可用于HMSNs負載吲哚美辛的實驗條件優化。通過P值分析，A、B、C、AC、BC、A2、C2項均達到了極顯著水平（P<0.01），表明IMC/HMSNs質量比、載藥時間、超聲時間以及IMC/HMSNs質量比與超聲時間、載藥時間與超聲時間的交互作用對吲哚美辛包封率均有顯著影響。

表2 Box-Behnken 實驗設計結果

表3 回歸方程各項的方差分析

2.2.2 響應面交互作用與優化

IMC/HMSNs質量比與載藥時間相互作用顯著，但對包封率變化影響不大[圖4(a)]。IMC/HMSNs質量比與超聲時間交互作用明顯，且坡度變化大，對包封率影響顯著[圖 4(b)]。載藥時間與超聲時間作用不顯著但對響應值作用明顯[圖 4(c)]。綜合考慮各因子的線性、二次及交互作用3方面的影響，在試驗考察范圍內，3個因素對包封率的影響依次為：IMC/HMSNs質量比、載藥時間、超聲時間。由3D圖可以發現，響應值存在最大值，進一步通過軟件分析計算，得到中空介孔二氧化硅球負載吲哚美辛的最佳實驗條件（表4）：IMC/HMSNs質量比為22∶1，載藥時間23h，超聲時間1.4h，包封率達85.2%。在得到的最佳負載條件下，進行3次驗證試驗（表5），包封率為84.1%，與理論預測值基本吻合，吻合度可達98.7%，證明了回歸模型的可行性。因此采用響應曲面法優化得到的HMSNs負載吲哚美辛的實驗參數準確可靠，具有一定的實用價值。

圖4 IMC/HMSNs質量比、載藥時間與超聲時間對包封率影響的響應曲面和等高線圖

表4 BBD優化結果

表5 驗證實驗結果

3 結 論

利用響應曲面法對HMSNs負載吲哚美辛的處方工藝進行優化，通過實驗和計算分析，以 22∶1的質量比，超聲1.4h，震蕩吸附23h時實驗條件達到最優，預測包封率可達85.2%，明顯優于現有的載體材料。在修正條件下對實驗結果進行驗證實驗，得到中空介孔二氧化硅球包封率為84.1%。與理論預測值基本吻臺，說明該回歸模型是合理有效的，為納米材料負載藥物的研究提供了新的實驗依據。

參考文獻

[1] HARADA S，NAKAGAWA T，YOKOE S，et al.Autophagy deficiency diminishes indomethacin-induced intestinal epithelial cell damage through the activation of ERK/Nrf2/HO-1 pathway[J].Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics，2015，9 （24）：1-28.

[2] 許崇文，秦思達，李碩，等.吲哚美辛誘導食管癌EC109細胞凋亡的 Smac依賴性機制[J].現代腫瘤醫學，2015，23（14）：1935-1939.

[3] 劉張玲，胡晶，黃崢蘭，等.吲哚美辛對 K562細胞株BCR/ABL-Wnt/β-catenin信號通路的影響[J].南方醫科大學學報，2015，35（7）：998-1002.

[4] 姜偉化，王東凱，王翔林.吲哚美辛新劑型研究進展[J].中國新藥雜志，2012，21（24）：2899-2902.

[5] 吳巧利，權桂蘭，洪瑜.介孔二氧化硅/乙基纖維素緩釋骨架的制備與釋放行為的研究[J].藥學學報，2014，33（8）：2089-2096.

[6] 楊惠，黃超.具有特殊形貌的介孔氧化硅的合成及其應用研究進展[J].化工進展，2014，33（8）：2089-2096.

[7] 黃超，楊惠，楊旭，等.介孔氧化硅負載貴金屬催化劑研究進展[J].化工進展，2014，33（6）：1459-1464.

[8] 張娟，任騰杰，胡顏薈，等.MCM-41分子篩負載金屬酞菁在氧化脫硫反應中的催化性能[J].化工學報，2014，65（8）：3012-3018.

[9] 桂萬元，王文謙，焦翔宇，等.基于中空介孔二氧化硅小球的 pH響應性控制釋放系統[J].中國科學：化學，2015，45（7）：703-709.

[10] 郝曉紅，張翠妙，劉小龍，等.基于介孔二氧化硅的多功能納米藥物輸送體系研究進展[J].生物化學與生物物理進展，2013，40 （10）：1014-1022.

[11] SHE X D，CHEN LJ，VELLEMAN L，et al.Fabrication of high specificity hollow mesoporous silica nanoparticles assisted by Eudragit for targeted drug delivery[J].Journal of Colloid and Interface Science，2015，445：151-160.

[12] DU P C，ZHAO X B，ZENG J，et al.Layer-by-layer engineering fluorescent polyelectrolyte coated mesoporous silica nanoparticles as pH-sensitive nanocarriers for controlled release[J].Applied Surface Science，2015，345：90–98.

[13] XU H J，ZHANG H J，WANG D H，et al.A facile route for rapid synthesis of hollow mesoporous silica nanoparticles as pH-responsive delivery carrier[J].Journal of Colloid & Interface Science，2015，451：101-107.

[14] BA-ABBAD M M，CHAI P V，TAKRIFF M S，et al.Optimization of nickel oxide nanoparticle synthesis through the sol–gel method using Box–Behnken design[J].Materials & Design，2015，86：948-956.

[15] 翟婷婷，王海媛，劉靜.響應面法優化超聲輔助提取普洱茶中類胡蘿卜素工藝研究[J].應用化工，2013，42（9）：1667-1672.

[16] 劉靜，翟婷婷，于曉倩.Box-Behnken 法優化不同孔徑 MCM-41包載β-胡蘿卜素的處方工藝[J].化工進展，2015，34（9）：3392-3399.

第一作者：王海媛（1991—），女，碩士研究生。聯系人：晉興華，博士，講師。E-mail 15822534131@163.com。

中圖分類號：R 944.9

文獻標志碼：A

文章編號：1000-6613（2016）07-2145-06

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.030

收稿日期：2015-11-23；修改稿日期：2015-12-09。

Optimization of indomethacin loaded hollow mesoporous silica nanoparticles by response surface method

WANG Haiyuan，SUN Minghui，REN Zhihui，ZHOU Fang，JIN Xinghua
（School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：The hollow mesoporous silica nanoparticles(HMSN) were synthesized in neutral aqueous solution at room temperature.Following this method，well-defined HMSN was prepared with a 25nm shell and a 250nm hollow diameter.Nitrogen adsorption-desorption analysis，Trans-mission electron microscopy，Fourier Transform Infrared Spectrometer were applied to characterize the synthesized HMSNs.The morphology of the HMSN was spherical.The BET result shows that the specific surface area of HMSN was 730.0m2/g，the average pore size was 1.084cm3/g，and the pore diameter was 6.58 nm.Experiments were designed according to a three-level Box-Behnken design to optimize the Indomethacin loaded HMSNs.The result indicated that HMSNs exhibited an excellent drug loading capacity.The optimal formulation parameters were as follows：IMC/HMSNs mass ratios(A)，loading time(B) and ultrasonic time(C) levels were 22∶1，1.4h and 23h，respectively and the best encapsulation efficiency could be 85.2%.The observed responses were in good agreement with the predicted values of the mathematic models，so the Box-Behnken design is suitable for optimizing the formulation of indomethacin loaded hollow mesoporous silica nanoparticles.

Key words：HMSNs；indomethacin；Box-Behnken design；encapsulation efficiency