微生物發酵法產脫落酸的研究進展

施天穹，彭輝，季榮鈺，石焜，曾斯雨，黃和，紀曉俊（南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

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進展與述評

微生物發酵法產脫落酸的研究進展

施天穹，彭輝，季榮鈺，石焜，曾斯雨，黃和，紀曉俊
（南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

摘要：脫落酸是一種以異戊二烯為基本單位的酸性倍半萜類物質，是一種重要的植物激素，在調節植物生長代謝、抵抗農業自然災害、增加農作物產量等諸多方面發揮著重要的作用，具有非常廣闊的應用前景。本文介紹了天然脫落酸的生物合成途徑，并從發酵菌株、發酵底物、發酵工藝、分離提取等方面闡述了微生物發酵產脫落酸的研究進展。同時討論了天然脫落酸發酵過程中存在的問題，如初始菌株產量低、發酵周期長、發酵工藝不穩定、產物提取效率低等，因此本文在此基礎上指出，篩選優良性狀的生產菌株、進一步研究脫落酸生物合成途徑中關鍵酶的酶學性質以及進一步開發脫落酸的先進發酵與分離提取工藝是今后研究的重點方向。

關鍵詞：脫落酸；倍半萜；發酵；灰葡萄孢霉

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種以異戊二烯為基本單位的酸性倍半萜類物質，與生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯同為植物的五大類內源激素，是一種重要的植物激素，除了能夠誘導植物抗逆基因表達，激活植物體內的抗逆免疫系統，提高植物自身對干旱、寒冷、病蟲害、鹽堿的抗性以外，還具有促進種子和果實貯存蛋白與糖分的積累，提高農作物與水果的品質以及控制花芽分化，調節花期等特性，因此具有較高的開發與應用前景[1-5]。由于天然脫落酸 [(+)ABA] 在植物中的含量非常低，每200kg的棉桃僅能提取9mg(+)ABA晶體，因此提取法很難實現(+)ABA的規模化生產。而化學法合成ABA，不僅步驟繁瑣，成本高，而且由于分子結構中存在手性碳原子，合成的產物是天然型(+)ABA與非天然型(–)ABA的混合物（如圖 1所示），其活性較低[6]，也很難廣泛地應用于大規模的農業生產。所以，長期以來，雖然(+)ABA具有很強的功效，但卻是五大類植物激素中唯一未能在生產上得到廣泛應用的植物激素。用微生物發酵法產ABA可以摒棄提取法和化學合成法的缺陷，得到的脫落酸是(+)ABA，具有活性、純度高等優點，有利于實現(+)ABA的工業化生產，解決(+)ABA價格昂貴、合成困難以及存在異構體的難題，能進一步促進其在各個領域的研究運用。

圖1 天然脫落酸及其對映異構體化學結構

1 脫落酸的生物合成途徑

與植物主要通過甲基赤藻糖磷酸（MEP）途徑生成脫落酸前體不同，微生物在代謝途徑中大多利用甲羥戊酸（MVA）途徑來生成脫落酸的前體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）與二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP）[7-9]，之后的合成途徑雖然在不同的微生物中略有差異，但主要的合成步驟已經基本確定，見圖2。脫落酸生物合成過程中，首先糖類、脂質、蛋白質在各自的代謝作用下生成乙酰CoA，一部分乙酰CoA進入三羧酸循環供能。與此同時，另一部分乙酰CoA流入MVA途徑形成IPP與DMAPP，兩者在異戊烯基轉移酶（isopentenyl transferases，IPT）和法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl diphosphate synthase，FPS）的作用下生成法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）。在大多數情況下，FPP可以直接合成ABA的初始骨架。但是，有一些研究表明[10]，在發酵培養底物中增加類胡蘿卜素的濃度，可以顯著提高微生物產ABA的能力，因此，并不能完全排除存在另一條與高等植物類似的類胡蘿卜素降解途徑生成 ABA骨架的可能性，其中的關鍵酶編碼基因還有待進一步的研究挖掘。最后，ABA 骨架再經一系列氧化反應后生成終產物ABA。

2 發酵菌株

自然界中可以積累 ABA的菌株主要有尾孢霉屬（Cercospora）、葡萄孢霉屬（Botrytis）、長喙殼屬（Ceratocystis）、曲霉屬（Aspergillus）等，見表1。在這些微生物中，尾孢霉屬、葡萄孢霉屬和曲霉屬產量相對較高。1977年，ASSANTE等[11]首次發現薔薇色尾孢霉（Cercospora rosicola）可以用來生產ABA，但存在著發酵時間長（30～40天），產量低（0.06g/L）的情況，很難用于大規模工業化生產。1982年，MARUMO等[12]開始使用灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）來生產(+)ABA。與前者相比，該菌的發酵時間顯著縮短，產量有所提升，具有較好的工業化生產前景，因此是生產(+)ABA的熱門菌株之一，受到廣泛的關注。在此之后，很多(+)ABA的工業化研究工作都圍繞著灰葡萄孢霉菌種的誘變篩選進行，并取得了一定的成果。如余永柱利用紫外激光復合誘變技術篩選出產量達到2.1mg/g的發酵菌種。鄭衍、吳江[14]從植物致病菌株中分離出的灰葡萄孢霉，經紫外和硫酸二乙酯多次誘變后，ABA產量提升了14倍，達374mg/L。

圖2 脫落酸生物合成途徑

譚紅等[15]利用紫外誘變、原生質體誘變等技術對菌株進行了遺傳學改良，使(+)ABA產量高達1.4g/L。隨后再采用DNA堿基定向誘變、關鍵酶基因改良等分子遺傳學技術手段，逐步改良篩選(+)ABA高產菌株，使ABA產量最終高達7.0g/L，隨后，建立了世界上第一條生產(+)ABA的工業化生產線，首次實現了(+)ABA的規模化生產及農業應用，帶動了(+)ABA生產與技術的發展。

表1 產（+）ABA的發酵菌株研究情況

3 發酵底物

微生物發酵產(+)ABA的過程中，很多糖類可以被微生物使用作為碳源，其中葡萄糖是最常使用的一種碳源。除此之外，淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖等也可以作為碳源被B.cinerea、C.rosicola等菌株使用并轉化為(+)ABA[15，22]。鄭珩等[10]以 B.cinerea為發酵菌株進行研究，深入考察了不同碳源對(+)ABA發酵產量的影響。結果表明，采用混合碳源比采用單一葡萄糖為碳源效果更好，當控制蔗糖與葡萄糖的比例為3∶2時，可使(+)ABA產量提高68.8%。添加其他碳源可以降低葡萄糖效應，加快菌體生長。當葡萄糖消耗完畢后，菌體再利用其它糖類作為碳源促進代謝產物的累積，可明顯提高（+）ABA的產量。

4 發酵工藝

4.1 固體發酵

微生物發酵生產(+)ABA的方法有固體發酵法與液體深層發酵法。早期(+)ABA主要通過固體發酵法制備。ASSANTE等[11]使用 C.rosicola產(+)ABA，產量達 0.06g/L培養基。DORFFLING等[19]從植物病原菌中分離出絲核菌、長喙霉、鐮刀菌、灰葡萄孢霉等并進行了30天的長時間培養，最大產量達4.6mg/L培養基。MARUMO[13]也利用固體發酵技術產(+)ABA，產量達到較高水平，約為0.74mg/g培養基。相比之下，我國對微生物發酵產(+)ABA的研究起步較晚，1993年，吳少伯[24]才開始使用固體發酵產(+)ABA，實驗以草莓灰葡萄孢為菌株，用固體發酵方式進行培養，得到的(+)ABA平均產量為3.94mg/L。隨后，吳江等[25]學者也進行了固體發酵法產(+)ABA的研究工作，并取得了一定的成果。在(+)ABA的發酵生產過程中，雖然固體發酵法工藝簡單，成本低廉，所需投資較少，但固態發酵始終存在著周期長、占地面積大、產量低、提純難等缺點，因此研究方向漸漸轉向能提高最終菌體生物量，縮小生物反應器體積，縮短發酵周期的液態發酵。

4.2 液體深層發酵

4.2.1 搖瓶液體發酵工藝優化

搖瓶培養是菌種篩選培育階段，目的是為了確定菌種培養的最佳操作條件，以便最終轉移到大發酵罐進行生產。因此對于微生物產(+)ABA發酵條件的優化，一直在持續地進行中。MASAO[23]發現在培養基中添加玉米提取物可以使(+)ABA的產量大幅提升。NORMAN等[26]研究不同光照條件以及單一和混合氨基酸對(+)ABA生物合成的影響，以提高其產量。TAKAYAMA等[27]研究在不同發酵階段的培養基中添加不同濃度的水仙植物提取物，最終使得(+)ABA產量提高了30多倍。國內學者吳少伯[24]考察了維生素A、檸檬酸鈉、玉米粉和葡萄糖這4種因素對(+)ABA發酵產量的影響，選擇四因素三水平的正交設計，優化各添加成分的濃度，使(+)ABA 液體發酵產量提高 122.3%，達 到622.3mg/L。張卉等[18]同樣使用了正交試驗法對野生黑曲霉的液體發酵條件進行優化，確定了最佳產酸條件。王惠等[28]使用了半天然 PD培養基生產(+)ABA，不僅提高了(+)ABA的活性，而且還降低了成本，更符合工業化的要求。鄭衍等[25，29]考察了不同營養添加物以及前體對(+)ABA產量的影響，并通過 Plackett-Burman設計與球面對稱設計對(+)ABA產生菌液體發酵培養基進行了優化。研究發現，當添加一定量的玉米粉、檸檬酸三鈉并控制蔗糖∶葡萄糖=3∶2時，可以使(+)ABA的含量提高4倍，達到212mg/L。因此，在(+)ABA發酵過程中確定最佳發酵條件是很有必要的，搖瓶發酵培養中得到的各項參數同樣也推動了液體深層發酵工藝的進一步優化。

4.2.2 分批發酵工藝

從搖瓶液體發酵中確定了最佳發酵條件后，為了擴大(+)ABA的生產規模，需要進一步放大發酵工藝，傳統的工藝采用分批發酵的方法。分批發酵是指在一個密閉系統內投入有限數量的營養物質后，接入少量的微生物菌種進行培養繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的微生物培養方法。與搖瓶培養相比，該工藝比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題，對營養物的利用效率較高，產物濃度也比較高，通過在罐內輸入氧氣滿足了菌種對氧氣的需求，并通過調控pH，攪拌等各項參數，使整個發酵過程處在更有利的條件下進行。但缺點是人力、物力、動力消耗較大，生產效率低。由于在分批發酵工藝中，營養物質是一次性加入的，與外界并沒有其他物質交換，因此只能完成一個微生物生長周期，特別是當產物濃度達到一定時，出現的產物抑制效應極大地阻礙了(+)ABA產量的提高，造成了資源的浪費[23]。

4.2.3 固定化菌體半連續發酵工藝

為了充分提升微生物菌種產酸能力，提高(+)ABA的產量，譚紅等[30]在液體分批發酵工藝的基礎上研發了固定化菌體半連續發酵工藝。該工藝在發酵過程中，采用了固定化細胞技術將菌絲體固定，調節溶氧、pH、溫度等參數降低菌體生長速率，并通過連續流加優化的液體培養基及前體，調控菌體的代謝途徑，提高了(+)ABA的產量。該工藝能使微生物產(+)ABA的產酸高峰期保持較長的時間，消除產物的阻遏作用，提高了單位時間產酸量，從而降低資源消耗，節約成本。利用固定化菌體半連續發酵工藝使得（+）ABA的產量最高達到了1.2g/L，遠超分批發酵工藝。但該技術工藝同樣存在著缺點，如工藝復雜，難以精確調控，且易染雜菌等。

4.2.4 (+)ABA批次流加補料發酵工藝

批次流加補料發酵工藝是在分批發酵工藝的基礎上流加培養基或營養物質來培養微生物的發酵方法。與上述發酵方法相比，該工藝不僅可以解除底物抑制，產物抑制，還可以控制雜菌，實現自動化控制，因此被廣泛使用于(+)ABA的發酵生產研究中。雖然用該工藝生產(+)ABA產量有所提高，但葡萄糖阻遏效應依然存在，當底物濃度較高時，會產生細胞代謝抑制作用，使菌體對其它糖的利用率下降，影響(+)ABA產量。因此，譚紅等[15]提出流加肌醇、人為控制碳氮比例的策略，解除了葡萄糖阻遏，提高了(+)ABA產量。與此同時，在分批流加發酵工藝的基礎上，添加了乙酰CoA作為前體，并使用生物表面活性劑吐溫-20改善了發酵罐內的溶氧情況。通過這些手段，菌株對氧氣的利用率顯著提高，菌株的底物轉化率與合成速率明顯加快，使(+)ABA的產量達到 6.0 g/L，進一步推動了(+)ABA的工業化生產進程。

5 分離提取工藝

經微生物發酵后的發酵液中除了含有（+）ABA外，還存在著很多其他的代謝產物，如何從這些混合物中分離出高純度、高收率的(+)ABA，成為了又一個難題。鄭衍等[31]對發酵生產(+)ABA的分離純化工藝進行了初步探索。發酵液經過濾、濃縮、去雜、乙酸乙酯萃取、NaHCO3反萃取、硅膠柱層析、結晶等步驟進行分離純化得到ABA，產品經光譜鑒定、旋光測定證實為(+)ABA，純度在98 %以上。該提取工藝路線步驟較短，操作簡單，重現性好，但是(+)ABA的收率較低，僅為39.7%。王天山等[32]用離子交換樹脂將發酵液中的有機物富集后，用乙醇解吸得到膏狀物，再經硅膠吸附后用石油醚洗脫得到脂溶性的油狀化合物，并進行了GC/MS分析，初步確定了這些脂溶性成分的主要來源，為改善整個發酵工藝及(+)ABA的分離提取工藝提供重要的數據依據。周金燕等[33]對(+)ABA的提取工藝做了進一步的優化，通過發酵液酸化后過濾，大孔吸附樹脂洗脫，洗脫液經過濃縮后萃取，萃取液濃縮后得到初提物。初提物溶解后用硅膠吸附雜質，加入乙烷等結晶助劑，減壓濃縮，冷卻結晶，洗滌，真空干燥，可得99%以上的(+)ABA，產品收率也達到了90%以上。

6 展 望

ABA作為一種重要的植物激素，在調節植物生長代謝，提高農作物產量，抵抗不良生長環境等方面發揮著重要的作用，具有廣泛的應用前景。植物提取法和化學法合成的ABA由于成本昂貴且活性低，難以實現大規模的工業化生產。所以用微生物發酵法產(+)ABA日益備受關注。從目前的報道來看，ABA大規模產量約為2～4g/L，雖然與野生菌每升幾十毫克的產量相比進步明顯，但與其它一些微生物發酵產物相比，脫落酸的產量還較低。因此，今后的研究工作可以從以下幾個方面展開。

（1）菌株是工業生產的靈魂，是決定發酵生產效率以及產業化或者商業化的關鍵因素。只有篩選獲得優良性狀的菌株，才有可能得到理想的發酵產品。因此應重視菌株的選育，利用物理、化學等聯合誘變方法及高通量篩選方法對(+)ABA生產菌株進行選育，以得到高產量菌株。

（2）進一步研究(+)ABA生物合成分子機制，解析脫落酸生物合成中的關鍵途徑并鑒定其關鍵酶，研究其酶學性質，為遺傳改造(+)ABA生產菌株奠定基礎。

（3）進一步開發高效低耗的(+)ABA提取工藝，為實現(+)ABA的規模化生產奠定基礎。

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第一作者：施天穹（1993—），男，碩士研究生。聯系人：紀曉俊，副教授，研究方向為微生物代謝工程。E-mail xiaojunji@njtech.edu.cn。

中圖分類號：Q 939.97

文獻標志碼：A

文章編號：1000-6613（2016）07-2140-05

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.029

收稿日期：2015-11-30；修改稿日期：2016-01-07。

基金項目：國家自然科學基金（21376002，21476111）、江蘇省自然科學基金（BK20131405）及江蘇高校優勢學科建設工程項目。

Production of abscisic acid by fermentation：a review

SHI Tianqiong，PENG Hui，JI Rongyu，SHI Kun，ZENG Siyu，HUANG He，JI Xiaojun
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

Abstract：Abscisic acid (ABA) is an important plant hormone，which plays a significant role in regulating plant growth，resisting agricultural natural disaster and increasing crop yields activity，etc.Therefore，it has broad application prospects.This paper makes a brief introduction about its biosynthetic pathway as well as the research progress in the production of abscisic acid by fermentation including the strains，substrates and the fermentation processes.The problems occurred during the fermentation of abscisic acid are also discussed，such as the low yield of original strains，long fermented time，deficient fermentation technology and low efficiency in product extraction.It is pointed out that more attentions should be paid to the breeding the ABA high-producing strains，the main enzyme activity in the biosynthetic pathway and the extraction and purified technology.

Key words：abscisic acid；sesquiterpenes；fermentation；Botrytis cinerea