谷跗線螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

趙學影，楊小迪，鄔玉蘭，劉志剛，孫　新

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谷跗線螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

趙學影1，楊小迪1，鄔玉蘭2，劉志剛2，孫新1

1．蚌埠醫學院，蚌埠233030；;2．深圳大學醫學院，深圳518060

摘要：目的揭示谷跗線螨Tarsonemus granarius體內存在泛變應原精氨酸激酶(arginine kinase，AK)。方法從空調濾網灰塵中采集谷跗線螨(約6 000只)并提取總RNA，反轉錄為cDNA，設計簡并引物，PCR克隆谷跗線螨AK片段，采用生物信息學軟件分析克隆基因的編碼蛋白特性。結果測序和序列分析結果表明，谷跗線螨AK基因的開放閱讀框由724個堿基組成，其編碼的蛋白相對分子質量約為26 019，等電點為10.10。結論成功克隆了谷跗線螨AK基因，為進一步谷跗線螨AK蛋白的重組表達以及過敏原性分析奠定基礎。

關鍵詞：谷跗線螨；精氨酸激酶；基因克隆；序列分析

塵螨過敏性哮喘等變態反應性疾病是臨床上的常見病、多發病[1]。實驗表明，利用粉塵螨過敏病人的血清IgE為探針做免疫組化染色，可誘發人體IgE抗體的變應原，主要分布于螨消化道、腺體及體壁等部位[2]。

精氨酸激酶(AK)廣泛存在于無脊椎動物如昆蟲、甲殼動物和軟體動物體內，是無脊椎動物能量代謝最重要的酶類之一，為其生命活動提供能量，并維持體內ATP的平衡[3-4]。另外，AK在昆蟲免疫反應方面也發揮著重要作用[5-9]，而對于谷附線螨過敏原蛋白與基因克隆方面的研究國內外尚未見報道，特以谷跗線螨為實驗材料進行研究，

1材料與方法

1.1試螨與試劑

1.1.1供試螨類活螨系從深圳大學學生宿舍分體掛壁式空調出風口濾網灰內采樣，將空調濾網取下，用刷子將濾網中的灰塵輕輕地刷至托盤中，在連續變倍體視顯微鏡下從灰塵中挑取并分離后經形態鑒定為谷跗線螨，用無菌水充分洗滌蟲體，濾紙吸干水分，液氮中凍存，備用。

1.1.2實驗菌種與載體大腸桿菌E.coliTop10由深圳大學過敏反應與免疫學研究所保存；pMD18-T 載體為Takara公司產品。

1.1.3主要的試劑和試劑盒RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；AMV First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司；質粒小量提取試劑盒[plasmid mini kitⅠ(100)]、瓊脂糖凝膠回收試劑盒[gel extractionkit(50)]和DNA膠純化試劑盒購自OMEGA公司；Ex-Taq酶、T4連接酶以及DNA Marker(DL2000)均購自Takara公司。

1.2簡并引物設計從SWISS-PROT 和TrEMBL(www.expasy.org)以及NCBI( www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank 等數據庫下載接近物種的AK基因的mRNA序列，利用分析軟件進行對比，選取同源性高的保守區域，根據這些區域設計并合成簡并引物。上游引物：AK-F: 5′ATGGTBGAYSCHGC 3′，下游引物：AK-R: 5′TTACAKBGABTTYTCMATCTT 3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3總RNA的提取和精氨酸激酶基因的RT-PCR擴增將采集的谷跗線螨約6000只，放在液氮中用研磨棒充分研磨后，轉入RNase Free離心管中，依照Qiagen公司RNA提取試劑盒說明書，按步驟提取谷跗線螨總RNA。按照Fermentas公司的AMV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成。以反轉錄獲得的cDNA第一鏈產物中取2 μL為模板進行PCR 反應，克隆精氨酸激酶基因。反應體系為50 μL：10×buffer 5 μL，10 ×dNTP 4 μL，ddH2O 39.75 μL，引物AK-F為0.5 μL，引物AK-R為2 μL，0.25 μL Ex-Tag 酶。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min 后用Touchdown方式進行擴增，第一個循環為94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，此后每個循環的退火溫度下降1 ℃，當退火溫度下降到50 ℃ 時，則以94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s運行30個循環，再于72 ℃延伸10 min結束。擴增產物電泳分離檢測，并切膠回收。

1.4RT-PCR產物克隆和測序回收純化的RT-PCR 產物與pMD18-T simple Vector進行連接，用氯化鈣法將連接產物轉入E.coliTop10克隆菌中。用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板進行抗氨芐篩選，挑取陽性菌落(含重組質粒)進行菌落PCR驗證。對陽性菌落進行過夜搖菌并提取其質粒，將陽性菌落進行序列測定(由上海生工完成)。

1.5序列分析將測序所得序列通過GenBank進行序列比對，并對該蛋白質的等電點和相對分子質量利用在線程序Compute pI/Mw too(http:/ /www.expasy.org/ tools/pi_tool.html)進行評估。利用在線程序CLUSTAL W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)將所得克隆進行序列分析。

2結果

2.1AK基因的PCR擴增以提取的谷跗線螨總RNA為模板，采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA轉錄成cDNA后，以谷跗線螨的cDNA為模板，用簡并引物進行PCR擴增。擴增的產物經瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，在723 bp左右有一亮帶。

Lane M: DNA standard markers;

2.2AK基因陽性克隆的鑒定回收RT-PCR產物，并與pMD18-T Vector連接后轉化E.coliTop 10。從平板中挑取白色菌落進行菌落PCR鑒定(圖2)，選取陽性菌落進行序列測定。

圖2谷跗線螨AK cDNA陽性克隆的菌落PCR鑒定

Fig.2Colony PCR identification of the positive clones containedT.granariuscDNA

2.3序列分析克隆得到的谷跗線螨AK基因(圖3)的開放閱讀框由724個堿基組成，其編碼的蛋白相對分子質量約為26 019，等電點為10.10。

圖3　谷跗線螨AK的核酸序列

3討論

近幾十年來，全球變態反應性疾病的發病率逐年升高，成為危害人類健康的主要問題之一。全球過敏性疾病發病率約15%～30%，主要有過敏性哮喘、過敏性鼻炎和過敏性胃腸炎等。過敏反應性疾病是由于人體吸入、食用或接觸變應原引起的。其中，塵螨是最常見的吸入性變應原之一。有關螨過敏反應方面的報道，大多集中在屋塵螨和粉塵螨過敏原的研究上，對這兩種螨過敏原及分子方面的研究已有很多[10-12]。而對谷跗線螨的研究報道較少，對其過敏原蛋白和基因克隆方面的研究國內外也未見報道。

精氨酸激酶廣泛存在于無脊椎動物如昆蟲、軟體動物和甲殼動物體內，是一種對能量代謝、貯藏和利用起重要調節作用的磷酸原激酶，這已在煙夜蛾等多種昆蟲中得到廣泛證實[13-14]。本研究采用RT-PCR方法，克隆得到了谷跗線螨的精氨酸激酶基因，證實谷跗線螨體內存在精氨酸激酶基因。研究發現，精氨酸激酶基因可以在昆蟲的多種組織中表達，但在不同組織內表達量差異較大。比如，意大利蜜蜂的ArgK基因在腦、觸角、復眼和胸部內均有表達，但在復眼的表達量最高[15]。家蠶的BmAK基因在腹足、脂肪體、表皮、中腸、絲腺中都有表達，其中在腹足中表達量最高，其次是脂肪體[13]。煙夜蛾的HassAK基因在幼蟲頭部、中腸、脂肪體、體壁和腹足中均可表達，其中以腹足和中腸的表達水平較高[14]。而精氨酸激酶基因在谷跗線螨體內的表達情況如何，有待進一步探明。

精氨酸激酶在昆蟲免疫反應方面發揮重要作用，直接或間接參與相關的免疫反應。研究發現，精氨酸激酶在誘導貝類源性過敏性疾病中發揮著重要作用[8]。德國小蠊、美洲大蠊等的精氨酸激酶為蜚蠊主要致敏原之一，可以誘發人類的一些過敏性反應[16]。精氨酸激酶也是家蠶的主要致敏原之一[17]。并發現在無脊椎動物如塵螨、蟑螂、龍蝦、貝等物種中存在IgE交叉反應的同源性[9]。前期實驗結果表明[2]，利用粉塵螨過敏病人的血清IgE為探針做免疫組化染色，可見谷跗線螨體內存在可誘發人體IgE抗體的變應原，主要分布于螨消化道、腺體及體壁等部位，提示谷跗線螨可誘發敏感患者產生IgE抗體。對分布于谷跗線螨這些部位的變應原是否是精氨酸激酶，有待于進一步研究證實。

此外，精氨酸激酶有可能成為新的害蟲防治的潛在靶點，因為精氨酸激酶是無脊椎動物體內不可缺少的、調節能量代謝的關鍵酶，且僅存在于無脊椎動物體內，其參與的代謝途徑與哺乳動物體內肌酸激酶參與的途徑不同；而傳統的化學農藥的使用又給環境和人類健康帶來不容忽視的影響，因此尋求新的害蟲防治手段具有重要意義。據研究報道，利用RNAi技術敲低家蠅幼蟲精氨酸激酶的表達后，可影響家蠅的生長發育，并能有效殺死家蠅，不會影響其他生物的正常和發育，具有較高的安全性[4]。隨著空調使用的普及，螨性哮喘發病率也呈上升趨勢，谷跗線螨作為我國南方地區空調濾網灰塵中的優勢螨種之一，借助空調送風已成為螨抗原一種新的、重要的傳播方式，尋找新的螨蟲防治手段勢在必行。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.009

通訊作者：劉志剛，Email：lzg195910@126.com；

Corresponding authors: Liu Zhi-gang, Email: lzg195910@126.com; Sun Xin, Email: sunxin@bbmc.edu.cn

中圖分類號：R384

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0148-04

收稿日期：2015-06-03；修回日期:2015-08-29

Cloning and sequence analysis of the arginine kinase genes in Tarsonemus granarius (Acari: Tarsonemidae)

ZHAO Xue-ying1,YANG Xiao-di1,WU Yu-lan2,LIU Zhi-gang2,SUN Xin1

(1.Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China;2.MedicalCollegeofShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Abstract:In order to clarify that the pan-allergen arginine kinase (AK) gene was existed in the body of Tarsonemus granaries, the live mites (about 6 000) were collected from the air conditioning filter, identified as T. granarius. The total RNA was extracted. The cDNA of AK was cloned, using degenerate primers, from the total RNA of T. granarius. The encoded protein characteristics was analyzed by bioinformatics software. The results of sequencing and sequence analysis showed that the full-length open reading frame of cloned cDNA contained 724 bp and the estimated molecular mass was 26 019(pⅠ10.10). It is concluded that AK was successfully obtained, which will be used for the further recombinant expression and allergenic analysis of T. granarius.

Keywords:Tarsonemus granarius; arginine kinase; gene cloning; sequence analysis

國家自然科學基金(No.81071388)資助

孫新，Email：sunxin@bbmc.edu.cn

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81071388)