融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區的登革病毒四價疫苗的構建及免疫效應研究

任守鳳，曹國梅，譚　峰，梁韶暉，劉文權，潘長旺

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融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區的登革病毒四價疫苗的構建及免疫效應研究

任守鳳，曹國梅，譚峰，梁韶暉，劉文權，潘長旺

溫州醫科大學基礎醫學院人體寄生蟲學教研室,溫州325035

摘要：目的構建編碼免疫佐劑Lipo多肽與登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII區的重組甲病毒載體，并在小鼠體內研究其免疫效應，為研制新型的登革病毒四價疫苗奠定基礎。方法先通過GS linker將編碼免疫佐劑Lipo多肽的基因序列與編碼登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII區的基因序列進行串聯獲得LipoEDIII；然后將LipoEDIII基因插入甲病毒載體DREP的多克隆位點，構建重組甲病毒載體DREP-LipoEDIII；將DREP-LipoEDIII轉染293細胞，Western blot檢測融合蛋白的表達；隨后將DREP-LipoEDIII免疫ICR小鼠，不加任何佐劑，再加強免疫2次后，通過ELISA檢測血清中的抗體效價和細胞因子的分泌情況來評價其免疫效應。結果成功構建了含有“融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區”的重組甲病毒質粒DREP-LipoEDIII。DREP-LipoEDIII免疫小鼠后可以誘導產生特異性抗體，抗體效價為1∶160?？乖碳ば∈笃⒘馨图毎梢援a生IFN-r 、IL-4、IL-10細胞因子，實驗組的濃度明顯高于對照組。結論在不需要加入任何外源佐劑的情況下，本研究構建的融合免疫佐劑Lipo多肽的登革四價疫苗能夠誘導小鼠產生特異性的體液和細胞免疫應答，且以細胞免疫應答為主，為今后新型登革病毒四價疫苗的研究奠定了基礎。

關鍵詞：登革病毒;包膜蛋白;甲病毒載體;四價疫苗

登革病毒(Dengue，DEN)屬于黃病毒科、黃病毒屬，包括4種血清型，均可以經蚊媒傳播引起人類登革熱[1]。初次感染登革病毒后所產生的抗體只能對相應血清型的病毒產生保護作用，當再次感染其它型別的病毒時，會由于抗體依賴性病毒感染增強作用(ADE)而加重病情，引起登革出血熱/登革休克綜合征[2]。所以一種理想的登革熱疫苗應能夠同時誘導生成對四種血清型產生中和作用的持久抗體[3]。

登革病毒是一種單股正鏈RNA 病毒[4]。基因組含單一開放讀碼框架，可以編碼3種結構蛋白和7種非結構蛋白。其中登革病毒E基因DⅢ區(EDIII)具有多種型及亞型特異性的中和表位和宿主細胞受體結合位點，而且E蛋白位于病毒顆粒的脂質雙層膜中，含有多種B 細胞表位和T細胞表位，是登革病毒的主要保護性抗原，是制備登革病毒亞單位疫苗的首選[5-7]。但是重組的EDIII抗原存在免疫原性差異，不能有效的誘導免疫保護作用。而脂質體蛋白Lipo(liposome)被認為是一種能夠有效提升免疫原性的佐劑[8]。研究證實，將Lipo多肽分別與DENV2和DENV4的EDIII融合表達后的重組蛋白能有效誘導特異性中和抗體的產生，并能降低產生ADE效應的風險[7-8]。因此，本研究擬利用連接肽(GS Linker)，將Lipo多肽與DENV1-4型的EDIII基因片段連接在一起，構建四價EDⅢ融合基因的重組甲病毒載體疫苗，然后將構建成功的四價重組質粒免疫小鼠，研究重組質粒的免疫原性及作為亞單位疫苗誘導小鼠產生體液免疫和細胞免疫反應的能力，為登革病毒質粒疫苗的研究奠定基礎[9-10]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和菌株甲病毒載體DREP為本實驗室保存。目的基因LipoEDIII由南京金斯瑞公司合成。大腸桿菌DH5a為本實驗室保存。

1.1.2細胞293細胞為本實驗室保存。

1.1.3實驗動物 ICR鼠(6～8周齡，雌性，清潔級)購自溫州醫科大學動物中心。

1.1.4主要儀器和試劑BcuI、SmaI和T4DNA連接酶等均購自Fermantas公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠二抗購自Fermantas公司， DNA 凝膠回收試劑盒、去內毒素質粒提取試劑盒為Omega公司產品。LipofectaminTM2000購自Invitrogen 公司。酶標儀購自美國Bio-Rad公司，ECM830電轉移購自BTX公司。

1.1.5引物設計根據本實驗室已經合成的DEN1-4病毒株基因組E基因DIII區基因序列設計引物引入限制性內切酶位點BcuI和SmaI用于后續重組質粒DREP-LipoEDIII的構建。引物設計:上游引物：5′-TCCCCCGGGCTCGAGATGAA

GAAA- 3′(劃線部分是BcuI的酶切位點);下游引物：5′-CGGACTAGTCTATCTAGAATGATGATGA-3′(劃線部分是SmaI的酶切位點)。

1.2方法

1.2.1構建重組質粒DREP-LipoEDIII用PCR擴增獲得含有目的基因LipoEDIII的一段序列，并用限制性內切酶BcuI和SmaI進行消化獲得目的基因LipoEDIII，目的基因大小約為1 500 bp.將其與經過限制性內切酶BcuI和SmaI消化的質粒DREP用T4連接酶進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞中，用含抗生素卡那霉素的固體培養基篩選得到陽性單克隆菌株，將篩選得到的陽性菌株送去測序，用DNAStar軟件對測序結果進行分析。

1.2.2質粒DNA的大量制備采用E.Z.N.A.公司的Endo-free質粒提取試劑盒(omega)提取質粒DNA,包括空質粒DREP，含登革1-4型病毒EDIII基因的重組質粒DREP-LipoEDIII。具體操作步驟參照試劑盒說明書。質粒用PBS磷酸鹽緩沖液溶解，并采用紫外分光光度儀測定A260和A280值，以確定質粒的純度和濃度。

1.2.3重組質粒的檢測將重組質粒DREP-LipoEDII轉染到293細胞中并用Western Blot的方法檢測目的基因LipoEDIII在293細胞中的表達:轉染前將293細胞接種于6孔培養板中，并加1 mL不含抗生素的完全培養基，以保證轉染時細胞匯合達90%～95%。按照LipofectaminTM2000操作說明，將重組質粒DREP-LipoEDIII和空質粒DREP分別轉染到293細胞中，空質粒DREP做對照組，37 ℃ 5%CO2培養箱中培養48 h后收集細胞，用Western Blot的方法檢測目的基因LipoEDIII在293細胞中的表達。

1.2.4免疫方案將ICR小鼠隨機分成3組，每組8只，第1-3組分別注射PBS磷酸鹽緩沖液、空質粒DREP、重組質粒DREP-LipoEDIII。每種質粒DNA每只鼠均注射50 μg/次，免疫途徑采用腿部肌肉注射。注射后立即對注射部位進行電刺激(EP)，電刺激的參數為：75 V、25 ms、 6次，每次間隔200 ms。免疫分3次進行，在初次免疫之后的第2周和第4周各加強免疫1次，免疫劑量與初次免疫一致。分別于初次免疫后第0、2、4和6周通過剪尾取血，在第10周時通過眼眶取血，取血后分離血清用于抗體效價的檢測。

1.2.5體液免疫檢測ELIAS法檢測抗體效價，用本實驗室制備純化的登革病毒四價重組蛋白TetEDIII包被ELIAS板，用倍比稀釋的小鼠血清為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，TMB顯色液進行顯色，抗體效價通過酶標儀測定的450 nm波長的OD值獲得，抗體效價通過一抗的稀釋比表示。

1.2.6細胞因子檢測1)脾淋巴細胞懸液的制備：將小鼠眼眶取血后頸椎脫臼處死，無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾，將脾臟放入1 mlL 1640細胞培養液中清洗，將清洗過的脾臟置于400目濾網上，用5 mL注射器內芯輕輕研磨，不斷向組織上滴加RPMI1640細胞培養液，直至組織內絕大部分細胞被分離，將細胞懸液小心加于含有淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，細胞懸液要加于淋巴細胞分離液的液面之上。18 ℃-22 ℃，400 g離心20 min。離心后，用吸管小心洗出分離液上層(包含淋巴細胞的細胞層)0.5 cm以上的上清部分，棄去。用吸管小心吸取分離液層及淋巴細胞層至于另一新離心管內。然后加10 mL PBS緩沖液混勻，250 g離心10 min，棄上清，用吸管以5 mL PBS緩沖液重懸所得細胞，250 g離心10分鐘棄上清，加1 mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液重懸細胞并計數，將脾細胞濃度用含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養液調整到107/mL。2)細胞因子的檢測：將脾淋巴細胞懸液稀釋到1×106/mL加到96孔板(100 μL/孔)，然后加入登革病毒四價重組蛋白(5 μg/mL)抗原刺激脾淋巴細胞產生細胞因子，用刀豆素(ConA 5 μg/mL)做陽性對照，37 ℃培養48 h后收集培養上清，-80 ℃保存備用，測定細胞因子的濃度。

2結果

2.1重組質粒DREP-LipoEDIII構建將空質粒DREP的結構基因CE1E2用目的基因LipoEDIII替換構建重組質粒DREP-LipoEDIII。

2.2LipoEDIII基因的PCR擴增及克隆酶切鑒定

PCR產物電泳檢測結果顯示1條大約1 500 bp的DNA片段，與擬擴增基因片段的大小相符，見圖2A。重組質粒DREP-LipoEDIII經過酶BcuI和酶SmaI雙酶切后，也可得到一條大小約為1 500 bp的DNA片段,見圖2B。結果表明重組質粒DREP-LipoEDIII構建成功。

2.3重組質粒DREP-LipoEDII的轉染和蛋白表達

圖1　重組質粒DREP-LipoEDIII構建示意圖

Fig.1Schematic diagram of the recombinant plasmid DREP-LipoEDIII

A： PCR擴增LipoEDIII基因；M: DL2502 DNA標志物;1：陰性對照;2，3：目的基因LipoEDIII

B：重組質粒DREP-LipoEDIII雙酶切鑒定；M: DL2503 DNA 標志物 1：DREP-LipoEDIII/BcuI-SmaI

A： PCR amplification of LipoEDIII gene; M: DL2502 DNA marker; 1: Negative control; 2, 3： LipoEDIII gene;

B: Identification of recombinant plasmid DREP-LipoEDIII by restriction enzyme;

M: DL2503 DNA marker; 1: DREP-LipoEDIIIdigested by BcuI and SmaI.

圖2LipoEDIII基因的擴增和鑒定

Fig.2Amplification and identification of LipoEDIII gene

檢測按照LipofectaminTM2000操作說明，將重組質粒DREP-LipoEDIII和空質粒DREP分別轉染到293細胞中，48 h后收集細胞，通過Western blot檢測重組質粒在293細胞中的表達。LipoEDIII重組蛋白大小約為48 Kd，Western Blot結果顯示構建的重組質粒DREP-LipoEDIII能夠在293細胞中成功表達，且表達的蛋白能被質粒免疫的小鼠血清所識別，如圖3A所示。同時，利用通過大腸桿菌表達系統制備的登革病毒四價EDIII重組蛋白TetEDIII也能被質粒免疫的小鼠血清所識別，如圖3B所示。

2.4抗體的產生水平及動態觀察不同時間對注射了重組質粒DREP-LipoEDIII，空質粒DREP及注射PBS磷酸鹽緩沖液的各8只小鼠取血，分離血清，用間接ELIAS法檢測抗體產生水平。結果顯示注射了重組質粒的小鼠抗體效價隨時間延長而不斷升高，第3次免疫后達高峰并能維持一段時間，抗體效價為1∶160，如圖4。

A．Western Blot檢測重組質粒DREP-LipoEDIII在293細胞中的表達，一抗為DREP-LipoEDIII質粒免疫小鼠的血清；1：蛋白分子量標準； 2：轉染重組質粒DREP-LipoEDIII的293細胞的樣品； 3：轉染空質粒DREP的293細胞的樣品

B．DREP-LipoEDIII質粒免疫小鼠的血清對登革病毒四價EDIII重組蛋白TetEDIII的識別；1：蛋白分子量標準； 2：通過大腸桿菌表達系統制備并純化的TetEDIII蛋白；3：Western Blot檢測重組質粒免疫小鼠血清對純化的TetEDIII蛋白的識別，一抗為DREP-LipoEDIII質粒免疫小鼠的血清

A: The expression identification of recombinant plasmids DREP-LipoEDIII in 293 cells; 1: Protein molecular weight marker; 2: Cell samples transfected with plasmid DREP-LipoEDIII; 3. Cell samples transfected with plasmid DREP.

B: The recognition of recombinant TetEDIII derived fromE.coliexpression system by using the serum of DREP-LipoEDIII immunized mouse; 1: Protein molecular weight marker; 2: Purified TetEDIII protein by SDS-PAGE; 3: Western Blot identification of TetEDIII protein by the serum of DREP-LipoEDIII immunized mouse.

圖3LipoEDIII蛋白的表達和鑒定

Fig.3Expression and identification of Lipo EDIII protein

重組質粒DREP-LipoEDIII誘導小鼠產生抗體于第2次加強免疫是抗體效價明顯升高達1∶80，第3次加強免疫之后達高峰，抗體效價為1∶160并維持一段時間。

圖4重組質粒DREP-LipoEDIII免疫小鼠抗體效價檢測

Fig.4Changes of antibody titers in mice immunized with recombinant plasmid DREP-LipoEDIII

2.5細胞因子檢測脾淋巴細胞培養48 h后收集上清測定細胞因子IFN-r，IL-4和IL-10。 其中，與空質粒DREP免疫組和PBS免疫組相比，重組質粒DREP-LipoEDIII免疫組均能誘導較高水平的IFN-r，IL-4和IL-10，分別為57 pg/mL, 22 pg/mL和120 pg/mL，如圖5A，5B，5C所示， 說明重組質粒DREP-LipoEDIII可誘導小鼠產生較強的細胞免疫應答，包括Th1和Th2反應。

重組質粒DREP-LipoEDIII免疫組，空質粒DREP免疫組和PBS免疫組小鼠脾淋巴細胞分別用重組蛋白LipoEDIII，刀豆素(ConA)和細胞培養液刺激后，檢測細胞因子IFN-r(A)，IL-4(B),IL-10(C)的分泌情況

The mice spleen lymphocytes of recombinant plasmid DREP-LipoEDIII group, plasmid DREP group and PBS group were stimulated respectively by dengue LipoEDIII recombinant protein, ConA and media to detect IFN-r, IL-4, and IL-10.

圖5免疫小鼠細胞因子檢測

Fig.5Cytokine detection of immunized mouse

3討論

到目前為止，尚未研制出安全有效的登革疫苗來預防此疾病的發生[11-12]。DNA疫苗是近年出現的一種新型疫苗，現已成為病毒疫苗研究的熱點[13]。由于DNA疫苗誘導的免疫應答往往不夠理想，所以通過優化免疫方案來提高質粒DNA的免疫原性就成為目前DNA疫苗的研究熱點。本研究首先通過融合免疫佐劑脂質體蛋白提高質粒DNA的免疫原性，其次，通過電刺激的方法提高質粒DNA的吸收效率從而提升質粒DNA的免疫原性[14]。

在DNA免疫中，研究者大多采用肌肉注射的方法進行免疫，由于肌細胞吸收DNA的效率較低，所以免疫應答往往不夠理想。目前，電擊技術在體外已被廣泛應用，主要用于將DNA導入真核細胞和細菌中，它主要是將短的電脈沖作用于靶細胞，穿透細胞膜，以便有利于細胞吸收DNA。在最近的研究中發現，體內組織如果加上電場也可以顯著提高DNA的吸收效率[15-16]。因此，我們每次注射質粒DNA后，立刻對注射部位進行電刺激，以提高肌細胞對質粒DNA的攝入效率，從而增強質粒DNA的免疫原性。

本研究使用的是甲病毒載體DREP，甲病毒是一類RNA病毒，能夠在宿主細胞的胞質內大量復制[17]。甲病毒載體是用外源基因替換結構蛋白基因的載體，仍具有甲病毒的宿主感染譜廣泛、能夠自我復制、誘導被轉染細胞發生凋亡等眾多生物學特性，同時能夠大量表達外源基因，激發機體產生高效的免疫反應，并不易與宿主基因組整合。因此，質粒DNA進入細胞后能夠自我復制，提高DNA的表達效率[18]。

與混合的重組疫苗相比，單一的多價疫苗具有成本低等優點。因此，本研究采用將登革病毒1-4型的EDIII基因連接在一起，構建四價登革病毒疫苗，從而更好的發揮免疫保護作用[19]。

本研究所構建的融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDIII區的登革病毒四價疫苗在小鼠體內具有較好的免疫原性，可以誘導小鼠產生體液免疫和細胞免疫，不僅誘導Th1反應而且還誘導Th2反應，為新型登革病毒疫苗的研究奠定了基礎。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.004

通訊作者：劉文權,Email：liuwq101@wzmc.edu.cn

Corresponding author:Liu Wen-quan, Email: liuwq101@wzmc.edu.cn

中圖分類號：R373

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0119-05

收稿日期：2015-05-18；修回日期:2015-11-23

Construction of fusion immunoadjuvants Lipo peptides and envelope protein EDIII dengue virus tetravalent vaccine and its immune effect

REN Shou-feng,CAO Guo-mei,TAN Feng,LIANG Shao-hui,LIU Wen-quan,PAN Chang-wang

(Department of Human Parasitology, School of Basic Medical Science, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035, China)

Abstract:We constructed a recombinant tetravalent DENV alphavirus vaccine coding of immunoadjuvants Lipo peptides and dengue virus type 1-4 envelope protein EDIII zone and studied its immune response in mice. Firstly, the gene sequence encoding immunoadjuvants Lipo and the gene sequence encoding dengue virus type 1-4 envelope protein EDIII zone was connected by GS linker to obtain LipoEDIII. Then, the gene LipoEDIII was inserted into the multiple cloning site of the alphavirus vector DREP to construct the recombinant alphavirus vector DREP-LipoEDIII. Furthermore, the 293 cells were transfected with the recombinant alphavirus vector DREP-LipoEDIII, the fusion protein expression was detected by Western blot. At last, the ICR mice were immunized with DREP-LipoEDIII without any adjuvant. The antibody titers in serum and the secretion of cytokines were detected by ELISA after the twice booster to evaluate the immune response. The mice immunized with DREP-LipoEDIII could induce specific antibodies and the antibody titer was 1∶160. The mouse spleen lymphocytes stimulated by antigen could produce cytokine including IFN-r, IL-4, IL-10, which were significantly higher in the experimental group. Our studies indicates that the tetravalent DENV alphavirus vaccine containing the fusion Lipo peptides can induce specific humoral and cellular immune responses in mice without adding any exogenous adjuvant, which laid the foundation for the research of novel tetravalent dengue virus vaccine in the future.

Keywords:dengue virus; envelope protein; alphavirus vector; tetravalent vaccine

浙江省自然科學基金項目(No.LY13C080001)資助

Supported by the Natural Science Project of Zhejiang Province (No. LY13C080001)