精異丙甲草胺脅迫下煙草根際土壤微生物的動態響應及其降解

侯少鋒++李榮玉++尹顯慧+龍友華++吳小毛

摘要：為了探明除草劑在煙草根際的降解與其根際微生物數量之間的關系，揭示煙草根際環境中除草劑快速降解的機制，采用室內模擬法研究精異丙甲草胺脅迫下煙草根際土壤微生物的動態響應及其降解動態。結果表明：在整個試驗周期內，無論是處理土壤，還是對照土壤，根際土壤微生物區系數量、土壤呼吸作用均高于非根際土壤，存在明顯的根際效應；真菌是精異丙甲草胺脅迫下的優勢菌群，能夠在該除草劑污染的根際土壤中旺盛生長；精異丙甲草胺在煙株根際土壤中更容易降解，與非根際土壤相比，根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率提高了1.23倍，半衰期縮短了18.77%。

關鍵詞：精異丙甲草胺；煙草根際；微生物；降解；動態響應；非根際土壤

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0493-03

收稿日期：2016-02-01

基金項目：國家自然科學基金（編號：21267007）；中國煙草總公司貴州省公司科技項目專項[編號：201311，編號：201414]；貴州省煙草公司畢節市公司項目（編號：BJYC-201304）。

作者簡介：侯少鋒（1987—），男，河北唐山人，碩士研究生，主要從事農藥環境毒理學及農產品安全評價研究。Tel：（0851）88297830；E-mail：460912660@qq.com。

通信作者：吳小毛，博士，副教授，主要從事農藥環境毒理學及農產品安全評價研究。Tel：（0851）88297830；E-mail：wuxm827@126.com。植物根際是根與土壤環境相互耦合的生態與環境界面，是一個較為特殊的微生態環境，由于其中的微生物活動非常旺盛，能加快土壤中有機化合物的分解及其他礦質元素的活化，根際環境，特別是有機污染物脅迫下的根際環境與一般土體存在顯著差別[1]。由于植物根系脫落物及根系分泌作用的存在，根際環境中pH值、Eh（氧化還原電位）、養分狀況的變化，將直接影響微生物組成、酶活性等物理、化學及生物學特性[2]。根際—土壤界面決定了污染物降解的過程遠較一般土體復雜，有關污染物在根—土界面的形態及毒性變化的研究一直是環境科學研究的熱點，但目前相關的研究主要集中于重金屬及有機污染物方面[3-7]。

精異丙甲草胺（S-metolachlor）別稱（S）-異丙甲草胺，是一種酰胺類除草劑，其化學名為2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）-N-[（1S）-2-甲氧基-1-甲基乙基]乙酰胺。精異丙甲草胺是一種選擇性芽前土壤處理藥劑，其主要作用機理為抑制發芽的雜草種子蛋白質的合成，其次是抑制膽堿類物質滲入磷脂，干擾卵磷脂的形成。精異丙甲草胺的殺草譜非常廣范，其主要防除對象為一年生的單子葉雜草、部分闊葉雜草和莎草，并被廣泛應用于玉米、馬鈴薯、水稻、大豆、煙草、蔬菜等多種作物的田間除草[8-11]。目前有關精異丙甲草胺脅迫下土壤微生物生態效應及其降解動態的研究較少，筆者選用煙株根際土壤為基質，采用室內模擬培養的方法，研究精異丙甲草胺脅迫下煙草植株根際微生物的動態變化及根際微生物對其降解潛力。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤在花溪煙草種植試驗地中，采集以煙草K326煙株為中心、15 cm半徑范圍的整個土塊，將抖落大塊土壤后的煙株根系連同與之緊密黏附的土壤置于保鮮袋中，帶回實驗室，仔細刷下并收集黏附于煙株根系的土壤，風干，過1 mm篩，保存備用。

1.1.2藥品及試劑精異丙甲草胺標準品[≥ 97.7%，85%（S）isomer]，購自美國迪馬科技有限公司。甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.1.3主要儀器設備6 890N氣相色譜（帶μECD檢測器）、HP-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國Agilent）、AL104分析天平（瑞士梅特勒）、YX-208B滅菌鍋（上海三申醫療器械有限公司）、SW-CJ-1FD超凈工作臺（杭州錢江儀器設備有限公司）、SHZ-82恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）、RE-52A型旋轉濃縮蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、 CH20生物顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、BIC-300人工氣候培養箱（上海博訊實業有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1土壤微生物區系的動態響應試驗分別稱取500 g根際、非根際土樣置于1 000 mL燒杯中，加入含精異丙甲草胺的甲醇溶液，使除草劑濃度均為6 mg/kg，待甲醇揮發后攪拌均勻，用蒸餾水調節濕度至土壤最大持水量的60%。土樣于25 ℃培養箱中恒溫培養60 d，每個處理均設置3次重復，同時設空白對照（CK），試驗期間定時稱質量補足水分含量。于1、3、7、14、21、30、45、60 d定時取樣測定，微生物計數采用固體平板梯度稀釋涂布培養計數法，細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養，真菌用馬丁氏培養基培養，放線菌用改良高氏1號培養基培養[12]。

1.2.2土壤呼吸作用測定采用直接吸收法測定[13]。稱取50 g土樣、1 g葡萄糖于100 mL燒杯中，加入少量水濕潤土壤后于25 ℃恒溫箱中避光培養7 d，然后添加含精異丙甲草胺的甲醇溶液并使其濃度分別為1、3、6、9、12 mg/kg。待甲醇揮發后攪拌均勻，用蒸餾水調節濕度至土壤最大持水量的60%，將裝有土樣的燒杯與盛有40 mL 0.2 mol/L NaOH的小燒杯一起置于密閉容器中，每個處理3次重復，同時設空白對照（CK），恒溫培養60 d，定期取出NaOH溶液用0.4 moL/L HCl溶液滴定，同時換入新鮮的NaOH溶液，繼續培養。根據HCl溶液的消耗量計算100 g干土的CO2釋放量。在整個試驗階段適時補水，以保持土壤含水量恒定。

1.2.3在根際土壤中的降解試驗分別稱取20 g根際、非根際土樣于100 mL錐形瓶中，加入含精異丙甲草胺的甲醇溶液，使其濃度均為6 mg/kg，待溶劑揮發后攪拌均勻，加入適量無菌蒸餾水，使含水量為田間最大持水量的60%，土樣于25 ℃恒溫培養箱內黑暗培養，每個處理均設3次重復，在整個試驗階段適時稱質量補水，以保持土壤含水量恒定。于0、7、14、30、60 d后取樣，采用液相色譜法測定精異丙甲草胺的殘留量[14]。

2結果與分析

2.1細菌的動態響應

由圖1可見，在整個試驗期內，根際土細菌數量均高于非根際土；與非根際土相似，經精異丙甲草胺處理的根際土壤，細菌的生長開始被抑制，到一定時間后被促進。在試驗前期（1～7 d），與對照土壤相比，施用精異丙甲草胺處理后，根際與非根際土壤細菌的生長基本受到抑制，在培養1 d時抑制作用達到最大值。隨后，各處理的抑制作用逐漸減弱，其中精異丙甲草胺在培養7 d時對根際土壤細菌生長的抑制效應消失，開始促進細菌生長，且促進效應一直繼續到試驗結束，并且細菌數量均顯著高于對照土壤（P<0.05）。經精異丙甲草胺處理的根際、非根際土壤的細菌數量在21 d到達最大值，其中處理根際土壤細菌數量比對照根際土壤增加了2815%，而處理非根際土壤細菌數量比對照土壤增加了780%，此時處理根際土壤細菌數量是處理非根際土壤的111倍，即處理土壤的根際效應R/S（1 g根際土壤中所含微生物數量與非根際土壤的相應值之比）為1.11，而對照土壤的根際效應R/S為1.06，差異均達到顯著水平（P<0.05）。

2.2真菌的動態響應

從圖2可以看出，精異丙甲草胺對根際與非根際土壤真菌的生長一直表現為促進作用，30～60 d內，真菌數量均明顯高于對照土壤。精異丙甲草胺處理土壤的真菌數量在14 d時到達最大值，其中根際土壤真菌數量比對照土壤增加了39.14%，相應的非根際土壤真菌數量比對照土壤增加了2953%，此時處理土壤的根際效應R/S也達到峰值，為114，對照土壤的根際效應R/S為1.08，差異均達到顯著水平（P<0.05）。在整個試驗周期內，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土中的真菌數量均要高于非根際土，但在試驗后期（45～60 d），根際與非根際土壤的真菌數量之間不存在明顯差異。

2.3放線菌的動態響應

由圖3可知，在培養期間，根際土壤放線菌數量均高于非根際土壤；精異丙甲草胺對放線菌生長的影響為抑制—恢復—刺激。處理1～14 d，與對照土壤相比，精異丙甲草胺處理下的放線菌生長受到抑制，1 d時抑制作用最大，根際土壤的最大抑制率為14.51%，非根際土壤的抑制率為1432%。精異丙甲草胺處理根際土壤的放線菌數量在14 d時達到峰值，此時，處理土壤的根際效應R/S也達到最大值，為1.07，差異也達顯著水平（P<0.05）。14 d后抑制作用逐漸減弱，其中精異丙甲草胺處理的根際土壤放線菌數量在21 d時恢復到對照水平，30 d時開始促進放線菌生長，且促進作用一直繼續到試驗結束，但差異明顯。在整個試驗周期內，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土中的放線菌數量均要高于非根際土。

2.4對根際土壤呼吸作用的影響

如圖4所示，與非根際土相似，施用除草劑對根際土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3 d時，土壤呼吸強度達到了最高值，精異丙甲草胺處理的根際土壤呼吸強度比對照土壤增加了18.82%，相應的非根際土壤呼吸強度比對照土壤增加了15.41%，處理根際比處理非根際土增加了15.32%，即處理土壤的根際效應R/S為1.15，對照土壤的根際效應R/S為112，差異均達到顯著水平（P<0.05）。隨后精異丙甲草胺對根際土壤呼吸的刺激作用逐漸減弱。45 d時，精異丙甲草胺處理根際土壤的呼吸在7～60 d內繼續保持刺激狀態，而非根際土壤的呼吸強度在45 d時基本與對照持平。在整個試驗周期內，根際土壤呼吸強度均高于非根際土壤。

2.5在根際土壤中的降解動態

由圖5可知，在培養60 d，根際土壤中精異丙甲草胺的降解率為86.67%，而在非根際土壤中的降解率僅為80.33%，差異均達到顯著水平（P<0.05）。精異丙甲草胺除草劑在根際土壤中的降解也可用一級反應動力學方程模擬（表1），根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率常數為0.032 3，相應的半衰期為21.5 d；非根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率常數為0.026 4，相應的半衰期為26.3 d。與非根際土壤相比，根際土壤中精異丙甲草胺的降解速率常數提高了1.22倍，半衰期縮短了18.25%。綜合精異丙甲草胺脅迫下根際土壤微生物種群數量變化，根際微生物具有加快除草劑降解的潛力，表明植物種植可能是實現土壤農藥污染治理的一種有效途徑。

3結論與討論

微生物是根際微域中最活躍的生物相，其在有機物根際污染生態系統中的作用尤為重要。本研究表明，在整個試驗周期內，無論是處理土壤還是對照土壤，根際土壤微生物區系數量、土壤呼吸作用均高于非根際土土壤，存在明顯的根際效應。所研究的除草劑精異丙甲草胺在煙株根際土壤中更容易降解，與非根際土壤相比，根際土壤中精異丙甲草胺的半衰期縮短了18.77%，降解速率提高了1.23倍。同時，精異丙甲草胺對細菌、真菌和放線菌的影響不同：細菌是先抑制后促進，真菌是持續促進，放線菌是抑制—恢復—刺激。真菌是精異丙甲草胺脅迫下的優勢菌群，均能夠在除草劑污染的根際土壤中旺盛生長。這說明土壤真菌在精異丙甲草胺的馴化作用下大多都具備了耐受除草劑的能力或者部分敏感菌群趨于消亡而耐受菌群能夠旺盛生長。本研究初步探討了精異丙甲草胺對煙草根際土壤微生物的影響及其降解動態，有關精異丙甲草胺對土壤酶活性的毒性效應方面有待進一步研究。

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